不同纳米材料对PCR优化作用的研究及机制探讨

2022-07-04 来源：刀刀游戏网

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

摘要

聚合酶链式反应（PCR）在分子生物学研究领域已经得到了广泛的应用，聚合酶链反应（PCR）是现代生物学和医学领域最常用的分子生物学技术之一，可以把一个单拷贝的目的DNA片段扩增到几百万倍。但在实际运用中，PCR技术存在一定的局限，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率等问题。因此，寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂具有很大的潜力和发展前景。

实验中，我们以283bp的λ DNA的再扩增PCR体系和非特异性扩增体系为测试体系，对树状大分子包裹的金纳米颗粒对PCR的作用进行研究。本实验采用第五代树状大分子纳米金颗粒(Au DENPs)为研究对象, 金原子与树状大分子的摩尔比为25:1, 50:1, 75:1, 100:1, 125:1五种Au DENPs作为添加剂。实验证明，包裹有不同浓度胶体金的树状大分子都能对PCR反应起到优化作用，而且随着胶体金浓度的增大，相应树状大分子的优化作用增强, 最优浓度越来越低。

据我们推断，Au DENPs的优化机制是胶体金的加入使树状大分子的“硬度”增大，当树状大分子与PCR各组分相互作用时，由于其表面的有效反应基团增多，提高周围PCR各组分有效反应浓度以及

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促使游离的聚合酶越来越倾向于与完全配对的引物和模板形成复合物的能力得到增强，从而增强反应的效率及特异性。

在此，我们以聚乙烯亚胺修饰的不同表面电荷多壁碳纳米管(CNT/PEI)为添加剂，探讨了不同表面电势对PCR优化的影响。试验结果表明再扩增体系的特异性和效率明显受到聚乙烯亚胺修饰的碳纳米管的表面电荷的影响。即使浓度为0.39 mg/L时，表面修饰正电荷的碳纳米管也能有效的优化PCR；电中性的CNT/PEI.Ac不能优化该体系；尽管带负电荷的CNT/PEI.SAH可以优化PCR, 但是它的最优浓度为630 mg/L, 比CNT/PEI最优浓度的103还要高。该实验结果表明CNT/PEI表面的正电荷和CNT/PEI.SAH的表面负电荷与PCR反应组分之间的电荷作用可以提高PCR扩增的特异性和效率, 碳纳米管的热传导性在PCR优化过程中没有起主导作用。

关键词：树状大分子包裹的金纳米颗粒，功能化碳纳米管，PCR，优化, 作用机制

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THE STUDY OF VARIOUS NANO-MATERIALS ON PCR

AND THEIR MECHANISM

ABSTRACT

Polymerase chain reaction has been identified as a fundamental technique in contemporary molecular biology research and clinical medicine. This gene amplification technique can increase the number of the copies of target genes by 6 orders of magnitude. Since its initial use in the early 1980s, this technique has been extensively refined and developed in order to improve the specificity and efficiency. Development of various additives to enhance the specificity and efficiency of PCR still remains a great challenge.

Here we report the use of dendrimer-entrapped gold nanoparticles (Au DENPs) as a novel class of enhancers to improve the specificity and efficiency of PCR. We showed that the Au DENPs were effective in optimizing error-prone two-round PCR in specificity and efficiency. With the molar ratio between gold atom and amine-terminated generation 5 poly (amidoamine) dendrimer (G5.NH2) in the Au DENPs, the optimum concentration of Au DENPs could be lower and lower. The present study suggests that the molecular mechanism of the enhancing effect of the dendrimer on PCR is presumably due to the interaction of PCR components with the amine groups on the surface of the dendrimers Our hypothesis is that the use of dendrimer-entrapped gold nanoparticles (Au DENPs) with decreased flexibility and close to spherical shape even after being interacted with solid surfaces or interfaces would overcome the drawbacks of pure dendrimers that can easily form a “pancake” shape. In this case, Au DENPs would have much more surface sites

III

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to be interacted with PCR components, effectively enhancing the PCR specificity and efficiency.

Here we also report the use of polyethyleneimine (PEI)-modified multiwalled carbon nanotubes (MWCNTs) with different surface charge polarities as a novel class of enhancers to improve the specificity and efficiency of PCR. The materials used included the positively charged PEI-modified MWCNTs (CNT/PEI), the neutralized CNT/PEI with acetic anhydride (CNT/PEI.Ac), and the negatively charged CNT/PEI modified with succinic anhydride (CNT/PEI.SAH). We show that the specificity and efficiency of error-prone two-round PCR are greatly impacted by the surface charge polarity of the PEI-modified MWCNTs. Positively charged CNT/PEI could significantly enhance the specificity and efficiency of PCR with an optimum concentration as low as 0.39 mg/L, whereas neutralized CNT/PEI.Ac had no such effect. Although negatively charged CNT/PEI.SAH could enhance the PCR, the optimum concentration required (630 mg/L) was more than 3 orders of magnitude higher than that of positively charged CNT/PEI. The present study suggests that the PCR enhancing effect may be primarily based on the electrostatic interaction between the positively charged CNT/PEI and the negatively charged PCR components.

Chen Jingjing (Biochemistry and Molecular Biology)

Supervised by Shi Xiangyang

KEY WORDS: Dendrimer-entrapped gold nanoparticles, Multiwalled carbon nanotubes, Polymerase chain Reaction, optimization, mechanisms

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摘要 .............................................................................................................................................. I ABSTRACT ................................................................................................................................... III 第一章绪论 ................................................................................................................................ 1

1.1 PCR技术及其优化概述 .................................................................................................... 1

1.1.1 PCR技术简介 ......................................................................................................... 1 1.1.2 PCR技术优化方法简介 ......................................................................................... 2 1.2纳米材料背景知识 ............................................................................................................. 6

1.2.1纳米材料 .................................................................................................................. 6 1.2.2 纳米材料在PCR中应用的研究进展 ................................................................... 7 1.3 树状大分子的研究现状 .................................................................................................. 13

1.3.1 树状大分子 ........................................................................................................... 13 1.3.2 树状大分子的应用领域 ....................................................................................... 14 1.4 碳纳米管背景知识简介 .................................................................................................. 15

1.4.1 碳纳米管 ............................................................................................................... 15 1.4.2 碳纳米管研究应用历史 ....................................................................................... 16 1.4.3 碳纳米管的分类 ................................................................................................... 16 1.4.4 碳纳米管的功能化 ............................................................................................... 16 1.4.5 碳纳米管在生物工程领域的应用 ....................................................................... 18 1.5 本论文的研究方向及研究意义 ...................................................................................... 18 第二章树状大分子包裹的金纳米颗粒对PCR的影响 ............................................................ 20

2.1 材料与方法 ...................................................................................................................... 20

2.1.1 PCR添加剂 ........................................................................................................ 20 2.1.2 实验试剂 ............................................................................................................... 21 2.1.3 再扩增体系 ........................................................................................................... 21 2.1.4 非特异扩增体系 ................................................................................................... 22 2.1.5 优化实验 ............................................................................................................... 22 2.1.6 PCR产物检测 ....................................................................................................... 23 2.1.7 Au DENPs与BSA的相互作用 ........................................................................... 23 2.2 结果与讨论 ...................................................................................................................... 24

2.2.1 扩增前后, Au DENPs的稳定性测试 .................................................................. 24 2.2.2 再扩增体系的构建 ............................................................................................... 24 2.2.3 G5.NH2对PCR优化的影响 ................................................................................. 26 2.2.4 {(Au0) 25 -G5.NH2}对PCR优化的影响 ............................................................... 27 2.2.5 {(Au0) 50 -G5.NH2}对PCR优化的影响 ............................................................... 29 2.2.6 {(Au0) 75 -G5.NH2}对PCR优化的影响 ............................................................... 30 2.2.7 {(Au0) 100 -G5.NH2}对PCR优化的影响 .............................................................. 32 2.2.8 {(Au0) 125 -G5.NH2}对PCR优化的影响 .............................................................. 34 2.2.9 结论 ....................................................................................................................... 34

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2.2.10 非特异体系的构建 ............................................................................................. 36 2.2.11 不同Au DENPs对非特异性体系扩增的影响 ................................................. 36 2.3 Au DENPs与BSA作用结果 .......................................................................................... 39 2.4 讨论 .................................................................................................................................. 41 第三章聚乙烯亚胺修饰的不同表面电荷多壁碳纳米管对PCR优化的影响 ........................ 43

3.1 材料与方法 ...................................................................................................................... 45

3.1.1 实验试剂 ............................................................................................................... 45 3.1.2 实验材料 ............................................................................................................... 45 3.2结果与讨论 ....................................................................................................................... 45

3.2.1 不同表面修饰的碳纳米管对PCR优化的影响 ................................................. 45 3.2.2 退火温度对PCR扩增的影响 ............................................................................. 49 3.2.3 延伸时间对PCR扩增的影响 ............................................................................. 49 3.3 结论 .................................................................................................................................. 50 第四章结论 .............................................................................................................................. 51 参考文献 ........................................................................................................................................ 52 硕士研究生阶段发表论文............................................................................................................. 56 致谢 ................................................................................................................................................ 57

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第一章绪论

聚合酶链反应（PCR）是现代生物学和医学领域最常用的分子生物学技术之一，可以把一个单拷贝的目的DNA片段扩增到几百万倍。但在实际运用中，PCR技术存在一定的局限，例如对复杂体系的扩增会出现非特异性产物扩增以及扩增效率等问题。因此，寻找可以提高PCR特异性和效率的添加剂具有很大的潜力和发展前景。

1.1 PCR技术及其优化概述

1.1.1 PCR技术简介

PCR(polymerase chain reaction)技术即聚合酶链反应，是1985年由美国PE-Cetus公司的人类遗传研究室Kary Mullis等人发明的一种具有划时代意义的分子生物学技术[1] 。此技术的诞生，实现了人们希望能够在体外选择性扩增DNA或RNA片段的愿望。PCR技术操作简单，容易掌握，而且结果也相对可靠，它极大地提高了基因操作的效率和基因操作的灵活性，与分子克隆（molecular cloning）、DNA测序（DNA sequencing）并列为分子生物学的三大主流技术。PCR技术的反应原理与细胞内的DNA复制相似，但PCR的反应体系要相对简单，主要包括DNA模板、dNTP、寡核苷酸引物、DNA聚合酶以及合适的缓冲液体系。具体反应过程分为以下三个步骤：(见图1-1)

1、变性(denaturation)：将反应体系混合物加热到90~96°C，维持较短的时间（大约15~30s），使得模板DNA双螺旋的氢键断裂，双链解链，形成单链DNA。

2、退火(annealing)：将反应体系温度降至特定的温度（引物的Tm值左右或以下），引物与DNA模板的互补区域结合，局部形成杂交链。

3、延伸(elongation)：将反应体系温度提高到70~74°C,在DNA聚合酶的作用下，4种脱氧核糖核苷三磷酸作为底物，以引物为固定起点，延5’→3’方向合成新的DNA链。

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图1-1. PCR过程图

变性、退火、延伸三个步骤称为PCR的一轮循环，这样经过多轮循环，将得到以指数扩展增形式产生的大量目标DNA产物[2, 3]。

随着科技的不断发展，PCR技术已经从最初只能扩增单纯已知两端序列之间的DNA片段，衍生出定量PCR、实时PCR (Real-time—PCR)、不对称PCR (Asymmetric PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、反向PCR(Inverted PCR)等多种相关技术，并被广泛应用农业、食品工业、医学及分子生物学等各个领域。鉴于PCR技术的划时代性，Mullis也因此在1993年获得了诺贝尔化学奖[4, 5]。

1.1.2 PCR技术优化方法简介

PCR技术虽然能够扩增出大部分的DNA片段，但是当遇到特殊的片段，例如长片段DNA，富含G-C的DNA片段等时，通常的PCR技术往往难以得到理想的实验结果，而会得到像无扩增产物或产生大量非特异性产物等不理想的结果。为了解决这个问题，综合考虑PCR技术的各个方面，人们通过三个方面来(1) 调整PCR反应条件，对PCR进行优化 (a) 模板核酸对PCR反应的影响

模板核酸的质量与数量对PCR的影响十分重要。虽然模板核酸可以为多种形式的DNA，但是需要预先纯化以除去蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以

优化PCR技术，以得到预期的实验结果。

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及能与DNA结合的蛋白质。理论上，要获得最好的特异性及忠实性的扩增最好只向反应体系中加入单一拷贝的靶序列DNA作为模板，但实验证明其PCR产量较低。

实验表明，在一定范围内PCR的产量随模板的浓度的升高而显著升高。为了获得较高的产量同时保证较高的反应特异性，通常PCR反应的模板加入量为102－105拷贝的靶序列。需要指出的是，扩增相同拷贝数的靶序列时，向PCR反应体系中加入的含靶序列的模板核酸的量是不同的。例如，3×105单拷贝的靶分子相当于1μg人基因组DNA、10ng酵母DNA和1ng大肠杆菌DNA[3]。 (b) Mg2+浓度对PCR反应的影响

研究表明，耐热DNA聚合酶的活性依赖于反应体系中的二价阳离子（Mg2+）。若反应体系中Mg2+浓度过低，会显著降低酶的活性，而Mg2+浓度过高时，又会导致酶催化非特异性扩增增强。而且，Mg2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物解链的温度，从而影响扩增片段的产率[6-8]。并且值得注意的是PCR反应体系中的模板DNA、dNTP、引物中的磷酸基团均可与Mg2+结合从而降低反应体系中的游离Mg2+的浓度，所以如何根据不同反应体系中模板DNA、dNTP、引物量的不同，来确定合适的Mg2+浓度，对PCR结果的优化来说很重要。 (c) 缓冲液的组成对PCR反应的影响

实验中经常用到的缓冲体系为Tris-HCl缓冲液，通常会在其中加入一定量的KCl来提高DNA 聚合酶活性，通常使用的最优 KCl 浓度大概为 50mM 左右，高于此浓度的KCl会抑制Taq DNA聚合酶的活性。并且还可以在反应体系中加入小牛血清蛋白（100μg/ml）或者明胶（0.01％）或者Tween20（0.05％－0.1％）或二硫基苏糖醇(DTT, 5mM)，这些物质有助于保护聚合酶。 (d) 聚合酶对PCR反应的影响

聚合酶的活性和浓度对PCR技术来说非常重要[9]。实验室中一般使用的是Taq酶，它的活性对Mg2+、K+、NH4+等离子的浓度较敏感，其中受Mg2+浓度的影响最大。有实验表明，Mg2+浓度在2.0mM时Taq酶的活性最高，若Mg2+浓度偏高时，则酶的活性将受到抑制。同时，因为Taq 酶没有校正阅读功能，在扩增过程中可引起碱基错配，通常可应用低浓度的dNTP(各20μM)、1.5mM的Mg2+浓度、高于55℃的复性温度，可提高Taq酶的忠实性。此时的平均错配率仅为5×10-6次/核苷酸循环(通常30次循环的Taq酶的错配率约为0.25%)。

聚合酶在PCR反应体系中的加入量也很重要，若酶量过少会影响靶序列扩增产量，而过多则会导致非特异性的扩增。通常 50ul 的体系中加入 1-1.25 个单位的聚合酶来进行扩增[3, 4]。 (e) 引物对PCR反应的影响

为了避免产生引物二聚体，减少引物与模板的非特异性结合，提高PCR的

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特异性，引物的设计要遵循一定的原则[10]。并且引物的量也需要特别注意，过低的用量会导致PCR产量的降低，过高的用量则会导致碱基错配、非特异性扩增和生成引物二聚体。

(f) 循环参数对PCR反应的影响

循环参数涉及到PCR程序中的各个环节。其中变性的温度取决于模板DNA分子的G+C含量和DNA聚合酶的稳定性，而变性的时间则与模板DNA链的长度及DNA聚合酶的热稳定性有关。变性温度过高或变性时间过长都会导致聚合酶失活，影响PCR结果。而退火温度由引物的碱基组成、长度和浓度来决定。合适的退火温度应低于引物Tm值5°C左右。过低的退火温度可提高PCR的敏感性，但是特异性较差，而较高的退火温度则可提高PCR反应的特异性，却降低反应的扩增效率。PCR程序中的延伸温度，应与所使用的DNA聚合酶的最适用温度相适应。一般如果使用的是Taq聚合酶的话，延伸温度一般定为72°C。 (2). 添加增强剂，对PCR进行优化

对于大多数的情况，上述的调整PCR反应条件的优化方法都是适用的，但是当遇到一些特殊的片段时，例如富含G-C的DNA片段或长片段时，上述方法的作用并不明显。以高G-C 含量模板扩增为例，其所面临的主要困难是模板中容易形成稳定的二级结构妨碍DNA 聚合酶在模板上的推进,以及模板上可能存在多个非特异性的引物局部复性位点,导致非特异性扩增。解决这个问题的一个方法是向体系中加入氢氧化钠，对PCR扩增模板进行变性预处理，破坏模板复杂二级或三级结构，或者在体系中一起加入c7dGTP和dGTP。c7dGTP是dNTP的类似物，能够有效地破坏 DNA 的二级结构，能够减少非特异性条带的产生

[11]

。从实验的角度来看，这些方法有一定的实用性，但是对最终的产物的质量

有一定程度的影响。所以，更多采用的是向体系中加入增强剂的方法。通常所加入的增强剂，大部分都属于有机促进剂，例如二甲基亚砜（DMSO）、甜菜碱（Betaine）等。这些促进剂的作用机理各不相同，所适用的范围也是不一样的。

二甲基亚砜（DMSO）的作用机理是在DNA 的水溶液中通过脱水作用导致DNA 结构的不稳定性,从而功能性的降低G+C富集区的熔点及解链温度提高了扩增效率。中南民族大学生命科学学院生物技术国家民委重点实验室的杨梦莹等人[12]，尝试用二甲基亚砜优化高G-C 含量小单孢菌基因组的PCR扩增。从图1-2中可以看到，在加入了2.0%、2.5%、4.0%浓度的DMSO后，PCR结果得到了明显的改善，但是当加入的DMSO浓度大于7.0%后，则表现出了抑制PCR结果的效应。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨 M 1 2 3 4 5 6

图1-2. 含不同浓度的DMSO的小单孢菌基因组PCR扩增电泳图谱

泳道M：DL2000 marker；泳道1-6DMSO含量分别是：0，2%，2.5%，4%，7%，10%

甜菜碱（betaine）是一种氨基酸类似物，它从两个方面优化PCR反应，一方面它可以增加Taq 酶的稳定性,防止其因温度升高而变性，另一方面降低双螺旋DNA 的稳定性,使二级结构易打开,从而促进高GC 含量基因的扩增。图1-3是解放军总医院做的优化高G-C含量p16基因PCR的效果图，从图中可以看到只有加入了浓度为2.5mol/L的甜菜碱的第五泳道，才出现了目标产物的条带[13]。

M 1 2 3 4 5

图1-3. 有机添加剂对p16 cDNA 扩增的影响

泳道1:无添加剂; 泳道2: 10%甘油; 泳道3: 10%甲酰胺; 泳道4: 10% DMSO; 泳道5: 2.5

mol/L 甜菜碱;泳道M: 100bp DNA Marker

(3) 采取不同PCR策略，对PCR进行优化 (a) 巢式PCR（Nested PCR）

巢式PCR是一种PCR的改良模式。它比传统的PCR技术多采用了一对引物，通过设计“外侧”、“内侧”两对引物进行两次PCR扩增。外侧引物的互补序列在模板的外侧，内侧引物的互补序列在同一个模板的外侧引物的内侧。通常先

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用外侧引物扩增 15～30 个循环,扩增出含有目的靶序列的交大的DNA片段，然后再用已扩增的 DNA 片段内设定的内侧引物扩增 15～30 个循环，从而获得目标产物[3]。由于两套引物都互补的靶序列很少，所以采用巢式PCR能够降低扩增多个靶位点的可能性，与只采用一对引物的PCR扩增相比，明显的提高了PCR检测的灵敏度，保证了产物的特异性。 (b) 降落PCR（Touchdown PCR）

降落PCR代表了一种完全不同的PCR优化方法，仅通过控制PCR反应的退火温度，达到优化PCR的效果。它的原理是在每一轮循环降低1°C退火温度，直至达到一个较低的退火温度，这个温度称为“touchdown”退火温度，然后以此退火温度进行10个左右的循环。这个策略有利于确保第一个引物－模板杂交事件发生在最互补的反应物之间，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。尽管退火温度最终会降到非特异杂交的Tm值，但此时目的扩增产物已开始几何扩增，在剩下的循环中一直处于主导地位[3]。编设降落PCR程序的目的是要设定一系列退火温度越来越低的循环，退火温度的范围应该跨越15℃左右，从高于估计Tm值至少几度到低于它10℃左右。目前大多数的PCR仪上都可以很方便地进行降落PCR。

由于耐热DNA聚合酶具有较广的作用温度范围，所以把PCR混合物在显著低于Tm值的温度下，哪怕是作简短的保温，也可能产生引物二聚体和非特异性配对。热启动PCR方法则可以大大减少这些麻烦。其操作方法是在第一个循环中等温度升到超过反应物的Tm值以后才允许反应中的一或两种关键成分进入反应。例如在覆盖有矿物油的PCR管中，所有反应管中的一种公用成分(如Taq DNA)聚合酶可以先不加，而到第一个循环的变性阶段温度超过80℃以后再加[4]。

1.2纳米材料背景知识

1.2.1纳米材料

纳米材料是指在三维空间内至少有一维处于纳米(1-100 nm)尺度范围或由它们作为基本单元构成的一种具有特殊性能的新型材料。目前纳米材料已经在工业、化学、医学、生命科学等领域得到了很好的应用[14-16]。

与传统材料相比，它具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高等特点，所以它会表现出传统材料所不具备的奇异或反常的物理、化学特性，如原本导电的铜到某一纳米级界限就不导电等。具体可以解释为纳米材料具有表面效应、小尺寸效应、宏观量子隧道效应。

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(1) 表面效应

球形颗粒的表面积与直径的平方成正比，其体积与直径的立方成正比，故其比表面积（表面积／体积）与直径成反比。随着颗粒直径变小，比表面积将会显著增大，说明表面原子所占的百分数将会显著地增加。对直径大于 0.1微米的颗粒表面效应可忽略不计，当尺寸小于 0.1微米时，其表面原子百分数激剧增长，甚至1克超微颗粒表面积的总和可高达100 m2，这时的表面效应将不容忽略[17]。 (2)小尺寸效应

随着颗粒尺寸的量变，在一定条件下会引起颗粒性质的质变。由于颗粒尺寸变小所引起的宏观物理性质的变化称为小尺寸效应。对超微颗粒而言，尺寸变小，同时其比表面积亦显著增加，从而产生如下一系列新奇的性质[13]： 1、特殊的热学性质

固态物质在其形态为大尺寸时，其熔点是固定的，超细微化后却发现其熔点将显著降低，当颗粒小于10纳米量级时尤为显著。例如，金的常规熔点为1063℃，当颗粒尺寸减小到10纳米尺寸时，则降低27℃，2纳米尺寸时的熔点仅为327℃左右[13]。

2、特殊的磁学性质

小尺寸的超微颗粒磁性与大块材料显著的不同，大块的纯铁矫顽力约为 80安／米，而当颗粒尺寸减小到2*10-2微米以下时，其矫顽力可增加1千倍，若进一步减小其尺寸，大约小于6*10-3微米时，其矫顽力反而降低到零，呈现出超顺磁性[13]。

3、特殊的力学性质

陶瓷材料在通常情况下呈脆性，然而由纳米超微颗粒压制成的纳米陶瓷材料却具有良好的韧性。因为纳米材料具有大的界面，界面的原子排列是相当混乱的，原子在外力变形的条件下很容易迁移，因此表现出甚佳的韧性与一定的延展性，使陶瓷材料具有新奇的力学性质[13]。 4、宏观量子隧道效应

微观粒子具有贯穿势垒的能力称为隧道效应。近年来,人们发现一些宏观量,如微粒的磁化强度、量子相干器件的磁通量以及电荷等也具有隧道效应,它们可以穿越宏观系统的势垒而产生变化,故称之为宏观量子隧道效应[13]。 1.2.2 纳米材料在PCR中应用的研究进展

自2005年李海阔等人[18]和李明等人[19]对纳米金颗粒优化PCR反应的研究先后面世以来，相关的研究层出不穷，更多的纳米材料被尝试使用在各种体系的PCR反应当中。

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(a) 纳米金颗粒在PCR中的研究进展

纳米金颗粒是最早被发现可以应用在优化PCR反应中的纳米材料。2005 年，李海阔等人[14]在 Angew Chem上发表封面文章首次报道纳米金粒子可以作为一种新型的PCR添加剂，对再扩增体系的非特异性扩增产生令人惊讶的优化效果。再扩增即将第一轮扩增的产物作为新的模板，用同一对引物进行第二轮扩增。通常情况下，第二轮扩增非常容易产生严重的弥散性条带，这是一个很好的研究非特异性问题的模式体系。在该体系中，加入适合浓度的无机纳米金粒子，产物显示为唯一的目标条带。我们称这一方法为“纳米粒子辅助的PCR方法”，为非特异性扩增问题的解决开辟了新的途径。在文中提到，当向PCR 体系中加入直径为10nm，浓度为0.4nM的纳米金后，显示出了很好的优化效果，见图1-4。

M 1 2 3 4

图1-4. 纳米金颗粒对PCR特异性的影响

泳道M: Marker; 泳道1、2：没添加纳米金的对照组；泳道3、4：添加了纳米金的优化组

文中还指出，纳米金的浓度对 PCR 的特异性起到了至关重要的作用，当纳米金浓度在适当的范围内（0.2-0.8nM）逐渐增加，电泳检测结果显示非特异性条带越来约少，目标条带逐渐增强，可以得到单一明亮的目标条带（283bp）。然而，像很多增效剂一样，当其浓度过量的时候，就会显示出抑制现象。如图 1-5 所示，不同浓度的纳米金对PCR扩增效果有着不同程度的影响。

M 1 2 3 4 5 6

图1-5. 不同纳米金浓度对PCR特异性的影响

泳道 M: markers；泳道1~6纳米金的浓度分别为：0.6、0、0.2、0.4、0.8、1.0nM。

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2009年, 他又提出纳米金颗粒可以提高TNF外显子1扩增的效率和特异性

[20]

, 如图1-6, 并且纳米金颗粒的作用机理是非常复杂的, 很可能存在多重效

应。首先, 纳米金颗粒可能和Taq酶相互作用。纳米金颗粒和蛋白分子存在非特异性吸附作用, 纳米金与反应体系中游离Taq酶可以可逆性结合, 动态调节聚合酶的活性。其次,可能是纳米金类似于单链结合蛋白。纳米金具有非特异性地选择吸附单链DNA, 不吸附双链DNA的性质, 可以与引物以及变性之后的单链模板之间形成竞争性吸附, 这种竞争性吸附有利于降低退火过程中引物和模板以及引物和引物之间的错配。

图1-6. 纳米金对基因组TNF exon1扩增影响。Blank为空白对照。

（b）纳米银颗粒在PCR中的研究进展

除了研究纳米金颗粒优化PCR的方向外，王群等人[15]在2007年发表的文章中，提到了用纳米银颗粒可以优化长片段DNA反复PCR扩增的特异性。

长片段DNA一般指的是长度超过5kb的DNA片段，这些长片段DNA很难通过常规PCR进行扩增，其原因可能是：1、常规PCR反应中应用的耐热DNA聚合酶(如Taq酶)缺乏3’ →5’核酸外切酶活性，不具备很好的校读功能，因而具有较高频率的错误碱基的掺入，不能有效扩增长片段DNA；2、较长的模板DNA容易形成高级结构，使DNA聚合酶难以与模板结合，也就实现不了其聚合功能；3、较长的模板DNA变性存在困难；4、缓冲液在PCR高温条件下可能会失去缓冲能力，造成模板DNA和产物DNA的损坏；5、二价阳离子在高温条件下也会促进DNA降解

[4]

。所以，反复扩增长DNA片段的难度更加大，很容易出现非特异性产物。而王群等人的实验发现，将粒径平均为70 nm的银颗粒添加在常规PCR热循

环体系中，使反应体系纳米银颗粒浓度达到0.1～1.2μg/μL，可以在一定程度上保持长DNA片段的PCR反复扩增反应的特异性。

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A B C

图1-7. 纳米银颗粒对6.77 kb 目标片段反复扩增的影响

M: Lambda DNA/HindⅢ Marker (BBI). A:第一次扩增.纳米银浓度（μg/μL）A1:0.0，A2:0.1，A3:0.2，A4:0.3；B:第二次扩增.纳米银浓度（μg/μL）B1:0.0，B2:0.1，B3:0.2，B4:0.3; C:

第三次扩增.纳米银浓度（μg/μL）C1:0.0，C2:0.1，C3:0.2，C4:0.3.

如图1-7所示，在实验中选取以人类基因作为模板, 长度为6.77kb 作为扩增目标，纳米银浓度为0～0.3μg /μL。结果显示：当样品中添加纳米银颗粒后，经过三轮扩增, 没有添加纳米银颗粒的空白样品1已经没有任何目标产物产生(C1泳道)。样品2、3、4的扩增结果类似, 有非特异扩增产物产生(C2、C3、C4泳道)。 (c) 纳米碳管在PCR中的研究进展

Ｃui Da Xiang等[21]，2004年就碳纳米管对PCR扩增效率的优化作用进行了探索, 他提出当SWCNTs添加到PCR体系后，PCR的扩增效率明显提高。当SWCNTs的浓度小于3μg/μl 时, PCR的扩增效率提高; 当SWCNTs的浓度高于3μg/μl 时, PCR扩增反应被抑制。他认为SWCNTs提高PCR扩增效率的机制可能是由于范德华力的作用。在PCR扩增中, SWCNTs跟Mg2+的作用相同, 是作为电子的提供者或接受者。

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1 2 3 4 5 6 7 8 M 9 10

图1-8. SWCNTs对410bp DAN扩增产物的影响。

泳道1–10, SWCNTs的浓度分别为0.33, 0.66, 0.99, 1.32, 1.65, 1.98, 2.31, 2.64, 2.97 和3.3

μg/μl；泳道M是Marker。

张治州等人[22]于2007年提出添加纳米碳管可以改善长片段DNA扩增的PCR结果。在文中，他们对一条14.395bp的DNA片段进行扩增，随着多壁纳米碳管的加入，长片段DNA的扩增的特异性逐渐增强。但是值得注意的是，当纳米碳管浓度超出它的有效范围（0.8-1.6μl/μg）后，将对扩增产生抑制作用，结果如图1-9所示。

1 2 3 4 0 M

图1-9. 多壁纳米碳管对于长DNA片段扩增的影响

泳道M：marker；泳道0：阳性对照；泳道1~4添加多壁纳米碳管：0.8μl，1.2μl，1.4μl，1.6μl

(d) 修饰过的纳米氧化锌材料在PCR中的研究进展

纳米氧化锌是一种新型高功能精细无机产品。与普通氧化锌相比,由于其尺寸介于原子簇和宏观微粒之间,具有纳米材料的小尺寸效应、表面效应、宏观量子隧道效应等许多宏观材料所不具有的特殊的性质,显示出诸多特殊性能如压电性、荧光性、无毒和非迁移性、吸收和散射紫外线等能力和用途,它在磁、光、电、敏感、抗菌消毒、紫外线屏蔽等方面具有普通氧化锌产品所不具备的特殊功

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用,是一种应用前景广阔的新型功能材料[25]。

Leng Nie等人[23]在2006发表的文章中，首次提出经硅覆盖的纳米氧化锌材料对PCR的产量有提高的作用。在文中，他们指出纳米氧化锌经硅覆盖后会呈现出“四角”结构，该结构对DNA有着很好的吸附性，可以提高PCR反应的产量。

图1-10. 纳米氧化锌“四角”结构电镜扫描图

曹雪雁等人[24]在2008年发表的文章中，首次提出第五代和第四代的聚酰胺胺树状大分子可以提高PCR的特异性和效率。随着树状大分子表面氨基的增多, 树状大分子的最优浓度可以达到1.35nM。树状大分子是一种可有潜力的PCR优化剂, 它可以有效的提高PCR的效率和特异性。他们认为树状大分子加入体系后能与dsDNA模板, ssDNA引物以及蛋白质（如聚合酶）同时发生相互作用, 如图1-11所示。因为树状大分子提高了PCR各组分的相对浓度, 从而大大提高了扩增反应发生的可能性。

图1-11. 第四代a和第五代b树状大分子对PCR扩增的影响

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图1-12. PCR混合物与树状大分子间相互作用的示意图。

红，黄，绿，蓝点：4种核苷酸；浅蓝色部分：聚合酶；短的单链：引物；长的双链：模板

1.3 树状大分子的研究现状

1.3.1 树状大分子

七十年代末，一些树状大分子被发现能够起到选择性客体或催化剂的作用。1978年Vögtle首次尝试用逐步重复的手段合成树状大分子。1985年，Tomalia和Newkome几乎同时分别独立发表了一种全新的树状大分子的合成方法，即发散法。该方法为高分子的合成开辟了一个全新的领域。20世纪90年代初，Fréchet等人首先采用收敛法合成了多种聚芳醚、聚芳酯等树状大分子。

树枝状大分子是一类通过支化单元逐步重复的反应得到的具有高分支化结构的大分子[25]。树枝状大分子与传统的线性大分子相比有以下几个显著特点: (1)前者有明确的分子量及分子尺寸,结构规整,易于在分子水平上精确控制分子体积、形状和功能基；(2)树枝状大分子一般由核心出发,不断向外分支,代数较低时一般为开放的分子构型,随代数的增加和支化的继续,从第四代开始,分子由敞开的松散状态转变为外紧内松的球形三维结构；(如图1-14) ,分子内部具有广阔的空腔,分子表面具有极高密度的官能团; (3)树枝状大分子有良好的反应活性及包容能力,在分子中心和分子末端可导入大量的功能性或反应性基团,用作具有特殊功能的高分子材料。

近几年来，树状大分子这一领域在不断向前发展，对其研究也取得了突破性的进展。而且，现在树状大分子的研究已逐步与其他领域，尤其是生命科学、材料科学等研究相关联，从而更扩展了其发展前景。

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核图 1-14. 第五代PAMAM树状大分子结构示意图

1.3.2 树状大分子的应用领域

高度支化的结构和独特的单分散性使树状大分子具有特殊的性质和功能,如可用于分析化学及主客体化学,可作为缓释药物载体、高效催化剂、纳米材料、信息储存材料、传感器材料、光电子开关、液晶材料、污水处理剂、分离膜等。 (1) 医学领域的应用

树状大分子具有稳定、无免疫原性、对生物活性剂的转运效率高、在使用剂量下不存在毒性等特点，已成为生物医学领域的研究热点之一。其研究主要集中在基因载体[26]、药物载体[27, 28]、硼中子俘获治疗试剂[29]和磁共振造影剂[30, 31]等方面。

以其中的基因载体为例，目前为止科学研究中常用的基因载体主要为病毒或脂质体两类。病毒虽然转染效率高，但受其本身体积所限，每次转染的基因量很少；而脂质体尽管能运载较大量的基因，但其稳定性不够且组织特异性差。相比之下，单分散性、稳定性好的树状大分子则具有明显的优势[32]。树状大分子能够通过其所携带的阳离子与DNA所带的阴离子之间的静电作用，实现运载较大量的基因，此外，其体系稳定，克服了病毒及脂质体所存在的缺陷。 (2) 催化剂方面的应用

树状大分子的结构呈树状，分子的内部含有大量的“空腔”，外部含有大量的活性功能基团。我们可以对分子内部的“空腔”大小，外部端基的数目以及分子之间的“距离”进行严格控制[33]。催化活性中心可以在树状大分子的外部，也可以在内部[34]。

比如，催化活性中心在内部的树状大分子。正如相关文献所述，树状大分子内部含有大量的“空腔”，因而其内部可以提供一种局域化的环境，这种环境适合固定催化剂以供其起催化作用。据Twyman报道，树状大分子内部的疏水性空间可以用来容纳催化剂，同时也可以催化疏水性客体分子的反应。据推测，其催化

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作用主要归因于两个因素。其主因是，由于PAMAM内部存在氨基，在反应过程中能形成高能级的四齿中间体，而这个中间体能降低反应活化能，从而催化反应速率。另一个原因在于，PAMAM内部呈疏水性，因而极易与同样呈疏水性的分子相结合，从而使参与反应的分子有效摩尔浓度增大。 (3) 纳米材料方面的应用

与单一相组成的纳米晶体材料和纳米相材料不同，“纳米复合材料”是由两种或两种以上的吉布斯固相至少在一个方向以纳米级大小(1-100nm)的材料复合而成的复合材料。树状大分子封装金属纳米粒子是一种新型的有机/无机杂化纳米材料，也是一种新型的纳米复合材料[35]。

纳米材料的制备需要合适的稳定剂或模板。而树状大分子本身具有特殊的结构特别适合做金属纳米粒子的主体。其独特之处在于：（1）组成及结构非常均匀，因此可以产生精细的纳米粒子复合物；（2）树状大分子能将纳米粒子封装于其内部或其他树状大分子之间，从而阻止纳米粒子的聚集；（3）被封装的纳米粒子由于空间效应而受到抑制，因而树状大分子的表面仍具有活性，能参与其他反应；(4)树状大分子能有效地控制外来分子与被封装的纳米粒子之间的相互接触; (5)树状大分子表面的端基能很好地促进其与其他聚合物的连接。

1.4 碳纳米管背景知识简介

1.4.1 碳纳米管

碳纳米管作为一种具有独特结构的一维量子材料，由于其所具有的独特的电子结构、力学与技术性能，碳纳米管在各个领域中的应用已引起了各国科学家的普遍关注[36]。碳纳米管凭借着本身所拥有的潜在优越性，决定了它无论在物理、化学、材料还是生物学科学领域都将有重大的发展前景。

图 1-15. 碳纳米管结构

纳米碳管1991年被日本科学家饭岛(Iijima)发现以来, 已在全世界范围内引起了各国学者的广泛关注和极大兴趣, 这一领域的研究也成为整个材料科学和

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凝聚态物理研究的前沿和热点。纳米碳管可以看作是二维的石墨烯片层卷积的结果, 其理想结构是由六边形碳原子网格围成的无缝、中空管体, 两端通常由半球形的大富勒烯分子罩住, 直径在几个到上百纳米, 长度则为几个到几十个微米。理论计算表明纳米碳管具有极高的强度和弹性模量(与金刚石相当) , 被称为超级纤维, 可用于高级复合材料的增强体。 1.4.2 碳纳米管研究应用历史

1991年，日本科学家饭岛(Iijima)在高分辨透射电子显微镜下检验石墨电弧设备中产生的球状碳分子时，意外发现了由管状的同轴纳米管组成的碳分子, 这就是现在被称作的“Carbon nanotube”，即碳纳米管, 又名巴基管。1993年, S.Iijima 等和D S .Bethune 等同时报道了采用电弧法，在石墨电极中添加一定的催化剂，可以得到仅仅具有一层管壁的碳纳米管，即单壁碳纳米管产物。1997年，A C.Dilln等报道了单壁碳纳米管的中空管可储存和稳定氢分子，引起广泛的关注。相关的实验研究和理论计算也相继展开。 1.4.3 碳纳米管的分类

碳纳米管按照石墨烯片的层数分类可分为：单壁碳纳米管（Single-walled Carbon Nanotubes, SWCNTs）和多壁碳纳米管(Multiwalled nanotubes, MWCNTs）。多壁管在开始形成的时候，层与层之间很容易成为陷阱中心而捕获各种缺陷，因而多壁管的管壁上通常布满小洞样的缺陷[37]。与多壁管相比，单壁管是由单层圆柱型石墨层构成，其直径大小的分布范围小，缺陷少，具有更高的均匀一致性。 1.4.4 碳纳米管的功能化

按照化学活性基团与碳纳米管是否存在化学反应, 功能化可分为共价功能化和非共价功能化两类, 其中共价功能化又分为端部和缺陷功能化、侧壁共价功能化两种情况。 (1) 共价功能化 (a) 端部和缺陷功能化

由于碳纳米管的端部含有碳五元环结构, 加上自身结构存在的拓扑缺陷、重新杂化缺陷和非完全键合缺陷, 使得端部与缺陷区域的碳原子具有较高的化学活性, 易被氧化形成一些具有反应活性的功能团。Tsang等[38]利用强酸对碳纳米管进行化学切割, 得到端部开口的碳纳米管, 发现开口端含有一定数量的羟基或羧基, 认为可以利用这些活性基团对碳纳米管进行有机化学修饰。常用的功能化

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路线是采用混酸处理, 在碳纳米管的端部和缺陷部位引入羧基或羟基, 并根据需要在这些基团上嫁接其它功能团。碳纳米管在羧基化的基础上进一步进行功能化有两种方式: 一种是用氯化亚砜将羧基转化成酰氯, 然后和含活性基团的化合物反应。如Smalley小组[39]将酰氯化碳纳米管与巯基十一胺反应, 在碳管上引入硫醇基团, 或者酰氯化碳纳米管与长链醇[40]、长链烷基胺[41, 42]及葡萄糖胺[43]反应, 生成可溶性碳管。另一种是在特定条件下让羧基化碳纳米管与化合物直接反应。如Eitan等用氢氧化钾作催化剂, 让羧基化碳纳米管与环氧树脂EPON828 直接反应, 得到环氧功能化的碳管。国内有曹春华等人[44]用羧基化碳纳米管和乙二胺在二环己基碳化二亚胺作用下直接反应, 获得含氨基的多壁碳管。 (b) 侧壁共价功能化

氟化是实现碳纳米管侧壁功能化的方法之一。例如Hamwi等通过碳纳米管与氟元素加成反应获得氟化碳管。氟化单壁碳纳米管的C-F键与富勒烯相似, 易与RLi、RMgX 或RONa 等亲核试剂通过加成-消除机理[45]发生取代反应, 在管壁上引入各种功能化基团。其它方法有: Peng 等[46]将高压裂解一氧化碳法制备的单壁碳纳米管与琥珀酸或戊二酸酰基过氧化物反应, 在管壁上嫁接2-羧乙基或3-羧丙基基团后再酰氯化, 然后与胺作用获得胺化碳管。郭金学等[47]则γ射线辐照多壁碳纳米管, 使得碳管表面的部分C-C键被打断, 然后对其氧化、酰氯化和胺化, 将癸胺基团嫁接到碳管上。上述功能化的过程都需要溶剂的参与。Dyke 等[20]报道了一种无溶剂功能化碳纳米管的方法: 他们将单壁碳纳米管和取代苯胺放在配有冷凝管和磁力搅拌器的瓶中, 再缓慢加入亚硝酸异戊酯, 边加热边搅拌, 最后过滤烘干获得功能化碳管。这种方法可用于大批量的碳管功能化, 同时降低了成本。通过共价功能化在碳纳米管表面嫁接一些特殊基团或分子链, 不仅能够增强碳管在溶剂中的溶解性, 还可以改善碳管在聚合物中的分散性与相容性[48]。但是, 共价功能化也存在着某些不足:一方面它会引入sp3 杂化缺陷, 降低碳纳米管本身的力学性能[49, 50]; 另一方面强酸氧化会使碳纳米管变短[51], 降低其长径比, 影响它对复合材料的增强效果。而非共价功能化则能够避免这两个缺点, 为碳纳米管的功能化提供了新的途径。 (2) 非共价功能化

碳纳米管侧壁的碳原子因sp2 杂化而形成高度离域化π电子, 这些π电子可与一些有机分子中含有的π电子形成π- π非共价键作用, 将这些分子吸附在碳管表面。Chen 等[52]利用芘与碳纳米管间的π-π作用, 将1-芘丁酸琥珀酸亚胺醚吸附在碳管表面, 再用含氨基的有机分子(如蛋白质、氨基酸)对其酰胺化, 获得表面含生物小分子的碳管。Steuerman等[53]的研究显示, 通过π-π相互作用, 共轭聚合物PmPV可以很好地包覆在单壁碳纳米管表面, 从而改善碳管在氯仿中的溶解性。单壁碳纳米管经PmPV 包覆后, 可以进一步在PmPV甲苯溶液中形成稳

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定的悬浮液。Xia 等用原位乳液聚合法在多壁碳纳米管表面包覆聚甲基丙烯酸甲酯( PMMA)或聚丙烯酸丁酯(PBA)。相对于共价功能化,非共价功能化既没有改变碳纳米管的杂化类型,也不会对碳管的结构造成破坏,即使在碳管表面包覆大量的功能团, 仍可得到结构完好的碳纳米管。但是碳纳米管外壁与功能团间的非共价键作用比共价键作用要弱许多, 这是非共价功能化的不足之处。对用于结构复合材料增强的、具有高长径比的碳纳米管而言, 功能团通过非共价键对碳管作用所能累积的总剪切力还是不小的,当然功能团具体的受力情况还与该复合材料的界面失效模式有关。

1.4.5 碳纳米管在生物工程领域的应用

碳纳米管在生物传感器方面的应用目前已取得较大进展[54]。使用碳纳米管修饰电极, 可以降低化学物质氧化还原反应的过电位,改善生物分子氧化还原可逆性,其大比表面积有利于酶的固定化。蔡等[55]制作了含葡萄糖氧化酶的碳纳米管阵列,这种复合材料制作的电极可以获得较低的葡萄糖氧化电位(0.3 V) ,避免其他物质的氧化。但是碳纳米管阵列的制备难度相当高,价格也比较昂贵。罗济文等[56]研究发现L-半胱氨酸在单壁碳纳米管修饰玻碳电极上产生的氧化峰电位大大低于其在裸玻碳电极上的电位。该修饰电极可用于测定药物中的L-半胱氨酸含量。唐婷等[57]在表面修饰有羧基化碳纳米管(CNTs-COOH)的金电极表面固定末端修饰氨基的寡聚核苷酸,制备新型核酸探针, 可以特异性结合目标单链寡聚核苷酸,从而提高了传感碳纳米管作为一种新型建筑材料越来越多的受到了人们的重视。凭借着卓越的综合性能，碳纳米管在我们生活中起着越来越重要的作用，虽然现在对碳纳米管的研究与应用尚处于起步阶段，但是相信随着对碳纳米管研究的不断深入，它作为一种全新，环保的功能材料，它在实际生活方面的应用前景将会更加广阔。

1.5 本论文的研究方向及研究意义

如前所述，科学家们从各个方向上寻找可以对PCR反应有优化作用的纳米材料，并取得了一些成果。他们验证了在某些用正常的方法难以扩增的体系中，可以使用一定浓度的纳米材料进行PCR优化，得到理想的目标产物，例如在长片段DNA扩增体系中，可以使用纳米银颗粒进行优化[19]。目前已知的对PCR反应有优化作用的纳米材料有纳米金[18]，纳米银[19]，纳米碳管[21]，修饰过的纳米氧化锌[23]，PAMAM树状大分子[24]等，它们在不同的PCR体系中存在优化作用。而树状大分子包裹的金纳米颗粒和不同表面电荷的PEI修饰的多壁碳纳米管

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在PCR优化作用中的相关研究并未见报道。

本文以283bp的λ DNA的再扩增PCR体系为测试体系，选择树状大分子包裹的金纳米颗粒和不同表面电荷的PEI修饰的多壁碳纳米管作为实验材料，研究这两种材料在再扩增体系以及非特异扩增体系中的作用效果，并尝试进行机制的初步研究，为今后纳米粒子在其他更广泛的生物领域的应用提供实验基础。

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第二章树状大分子包裹的金纳米颗粒对PCR的影响

PCR技术在某些复杂环境或条件下存在特异性差，效率低的缺陷，而我们在前期的研究中发现树状大分子对PCR反应具有良好的优化作用。结合树状大分子的结构特性，我们在本次实验中尝试在其内部包裹胶体金来改变其形态进而使更多的活性基团得到暴露，从而达到优化PCR的目的。根据前期各位科学家的研究，甜菜碱等有机小分子、纳米级金属粒子以及树状大分子都对PCR反应具有优化作用。然而树状大分子在优化过程中具有一个特性，即其本身十分柔软，所以当其与PCR各组分作用时会形成饼状，这也就导致其表面一部分的氨基基团未能暴露出来，即表面有效基团减少，从而在一定程度上影响了树状大分子的优化能力。正是从这个点出发，我们尝试通过使树状大分子包裹胶体金而改变其“硬度”，使其暴露在表面的有效氨基基团增多进而增强其优化作用。

此外，由于再扩增体系的两轮扩增使用同一套引物，所以即使第一轮扩增能的到单一条带，第二轮扩增还是常常会失败，出现一些大片段的非特异性条带或者弥散带。而这个特性正好可以使其作为一个很好的筛选添加剂优化性能的模式体系。

本实验选用G5-PAMAM作为实验材料，在其内部分别包裹摩尔比为25:1, 50:1, 75:1, 100:1和125:1的胶体金合成各种“硬度”的树状大分子衍生物。以扩增λ DNA基因的PCR反应作为测试平台，分别加入待研究的树状大分子，通过琼脂糖电泳对扩增产物进行检测，从而确定具有优化效果的材料的最佳优化浓度。由于待研究的树状大分子表面性质基本相同，不同材料间优化浓度的差别主要是包裹纳米金浓度的差异产生的。结合PCR实验结果与包裹纳米金的浓度绘制图表，得到不同硬度树状大分子的优化规律，并初步探讨可能的优化机制。

2.1 材料与方法

2.1.1 PCR添加剂

本实验选用第五代的聚酰胺胺树状大分子(G5.NH2)为实验材料，根据文献[58]合成金原子与树状大分子摩尔比为25:1, 50:1, 75:1, 100:1和125:1的树状大分子包裹的纳米金颗粒(Au DENPs), 合成路线如图2-1所示。根据图2-2所示, 摩尔比为25:1, 50:1, 75:1, 100:1和125:1的Au DENPs在超纯水中很稳定, 溶液颜色澄清透明, 在室温下静置2d后没有任何沉淀产生。随着金原子与树状大分子的摩尔比的增加, 溶液颜色由浅粉色变深棕色。

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图2-1 Au DENPs合成路线

图2-2. 室温下, 不同摩尔比的Au DENPs在超纯水中的稳定性

2.1.2 实验试剂

本实验使用的原始模板为λ DNA (TaKaRa Bio. Inc.)。Ex Taq DNA 聚合酶、dNTPs、DNA Marker DL2000 (2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp, 100bp)、 BSA(分子量为64kD，粒径约为7.0nm)从上海皓嘉生物公司购得。实验中试剂的配置、模板的稀释等用到的水由MilliQ纯水仪制得的超纯水(电阻为18 MΩ·cm)。所用的引物由上海生工合成，引物序列分别为:引物1: 5’-GGCTTCGGTCCCTTC TG T-3’, 引物2:5’-CACCACCTGTTCAAACTC TG-3’, 引物3:5，-GAACCCAGTC AT CAGCA-3，和引物4: 5，-ATAGTTTTATTGG AGCT TGT-3，。扩增在S1000TM Thermal Cycler (Bio-Rad Inc.)上进行。

2.1.3 再扩增体系

本实验中采用的测试体系为再扩增体系[18]。再扩增体系，指的是将第一轮扩增的产物作为新的模板，用同一对引物进行第二轮扩增。通常情况下，第二轮扩增非常容易产生严重的弥散性条带，这是一个很好的研究非特异性问题的模式体系。

(1) PCR反应热循环程序

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本实验的两轮扩增所使用的PCR反应热循环程序一样。

第一步：95℃预热 5 min；第二步：包括35个循环，每个循环包括：94℃变性20 s，55℃退火30s，72℃延伸30s；第三步：72℃延伸5 min，并于4℃保存。 (2) PCR反应体系

25μL反应体系中各个组分的比例如下：

10*Buffer 2.5μl dNTP 2μl 模板 1μl 引物1 0.5μl 引物2 0.5μl Taq酶 0.125μl H2O 18.375μl 2.1.4 非特异扩增体系

将大鼠尾提取出的基因组DNA做为模板，以Thy-1基因(1026bp)为目的扩增片段。引物3: 5，-ATGAACCCAGTCATCAGCA-3，和引物4: 5，-ATAGTTTTAT TG GAGCTTGT-3，为引物。 (1) PCR反应热循环程序

第一步：94℃预热 1min ；第二步：包括35个循环，每个循环包括：94℃变性15s，49℃退火15s，72℃延伸30s；第三步：72℃延伸1 min，并于4°C保存。 (2) PCR反应体系

25μL反应体系中各个组分的比例如下：

10*Buffer 2.5μl dNTP 2μl 模板 2μl 引物1 0.5μl 引物2 0.5μl Taq酶 0.125μl H2O 17.375μl 2.1.5 优化实验

为了获得准确的实验结果，并找出可能存在的纳米材料对PCR反应的优化规律，在本研究中采取了多步实验法。第一步，根据文献，初步设定一个纳米材料的作用范围，然后在PCR体系中加入纳米材料，进行定量梯度实验，试探寻找实

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际的作用范围。第二步，缩小范围，再次进行定量梯度实验，确定纳米材料的作用浓度上限与下限。重复这两步，直到收集到足够的信息，证明纳米材料对PCR反应存在影响。 2.1.6 PCR产物检测

扩增后的产物是用1%的琼脂糖凝胶电泳来分析的，上样量的大小为4μL，即从每个反应管中取出3μL的反应液和 1μL 6×上样缓冲液混和。凝胶用溴化乙锭来染色, 最终放在凝胶成像系统成像得到电泳图。

因为电泳图像中条带的亮度可以作为衡量产量的一个标准，所以可以应用WCIF Image J软件测量各泳道中目标条带的亮度，将没有添加任何纳米材料的阳性对照的亮度作为基准, 设定为1, 其他的亮度与该亮度进行比较后的数值，可以用来作为衡量相对目标产物产量的指标。

而对各泳道中目标产物特异性的考察，可以使用WCIF ImageJ软件，分别测量各泳道中有条带区域的浓度值和目标条带区域的浓度值，将两者进行比较，得到一个信噪比数值，这个数值的范围为0~1，数值越大说明泳道中存在的目标条带区域的比列越高，即PCR结果的特异性越强。

最终将分析的结果，用Origin 7.0软件作图进行说明。 2.1.7 Au DENPs与BSA的相互作用

光子相关光谱法(Photon correlation spectroscopy，简称PCS)是八十年代末出现的一种分析纳米及亚微米颗粒粒度的方法，目前已日趋成熟，得到国际社会的广泛认可，在国内也开始普遍应用[59, 60]。PCR体系中的蛋白质的大小与dendrimer处于同一量级，所以我们可以根据dendrimer粒径的变化来研究它们与BSA的吸附作用。具体步骤如下：

（1）测试温度为25℃，溶剂为PCR buffer；

（2）固定BSA的终浓度为0.75M，待测dendrimer的浓度为50M，分别测

量每种物质的粒径；

（3）将BSA分别与待测dendrimer混合，混合比例为0.75M : 50M，保证

dendrimer在混合体系中为绝对过量；

（4）静置作用30分钟后，测量各混合物的粒径大小；

（5）比较混合物粒径的变化，判断dendrimer与BSA作用情况。

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2.2 结果与讨论

2.2.1 扩增前后, Au DENPs的稳定性测试

在实验中，我们将五种不同金原子与树状大分子摩尔比(25、50、75、100

和125)的Au DENPs配置成0.1mg/mL的水溶液。超声后10分钟, 用紫外分光光度仪进行测量, 可以看到在520nm左右的波长时存在一个峰值, 该峰值是纳米金颗粒的吸光峰值。然后将这些溶液放进行PCR, 反应程序为: 第一步: 95℃预热5 min; 第二步: 包括35个循环, 每个循环包括: 94℃变性20 s, 55℃退火30s, 72℃延伸30 s；第三步: 72℃延伸5 min，并于4°C保存。最后, 将这些溶液重新进行紫外分光光度仪的测量, 将两次得到的实验数据, 进行比较, 结果见图2-3。如图所示，PCR反应前后，在520nm左右波长时有一个峰值, 该峰值是纳米金颗粒的吸光峰值。这说明: 在PCR扩增后，Au DENPs的物理和化学性质没有发生变化。

图2-3. 不同摩尔比的Au DENPs扩增前(a)和扩增后(b)的紫外光谱图

2.2.2 再扩增体系的构建

本实验中采用的测试体系为再扩增体系。再扩增体系，指的是将第一轮扩增的产物作为新的模板，用同一对引物进行第二轮扩增。通常情况下，第二轮扩增非常容易产生严重的弥散性条带，这是一个很好的研究非特异性问题的模式体系。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

图2-4. 再扩增体系正常PCR电泳图。

第一轮PCR扩增(泳道1, 2 )和第二轮PCR扩增结果(泳道3, 4)。泳道M是marker.

如图2-4所示，本实验中使用的283bp的λ DNA的再扩增模板，在正常的PCR体系下进行扩增，除了会产生目标产物外，还会得到一系列的非特异性产物。再扩增体系产生弥散条带的机理目前尚不清楚。有人提出导致出现大量非特异性产物条带的原因可能是上一轮的扩增中因副反应得到的一些非特异性片段的浓度刚好达到一个量，在这个浓度下，这些因副反应得到的非特异性片段比目标片段PCR有更好的动力学特征，所以可以直接利用的目标产品的DNA为模板，累积迅速。即使在本轮扩增开始时，目标产物的量会占主体，但是随着进一步循环，得到的目标产物DNA变性解链成单链DNA，就会参与到副反应中，扩增出非特异性片段[33]。所以，最终经过35轮循环得到的产物中，既有目标产物，也有非特异性产物，出现弥散条带。

一般情况下，解决需要进行二次扩增得到足够量的目标产物的方法是采用巢氏PCR（nested PCR）。巢氏PCR的原理是采用了内外两对引物，因为两套引物都互补的靶序列很少，所以采用巢式PCR能够降低扩增多个靶位点的可能性，与只采用一对引物的PCR扩增相比，明显的提高了PCR检测的灵敏度，保证了产物的特异性。但是巢氏PCR需要在第一次扩增反应结束后要打开反应管, 除去第一套引物, 再加入第二套引物, 所以操作比较复杂, 而且易造成反应系统污染。虽然现在有人设计出了一次性巢氏PCR反应，但是因为其对引物设计的要求比较高，而且效果和普通的巢氏PCR相比还是有着一定的差距[5]。

本实验的目的就是希望能够找到合适的纳米材料作为添加剂，在只有一套引物的情况下，用普通的PCR策略解决二次扩增会出现大量非特异性产物的问题，得到理想的目标产物。

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2.2.3 G5.NH2对PCR优化的影响

实验结果说明G5.NH2对PCR反应具有优化效果。从图2-5中可以看出, G5.NH2作为添加剂加入到PCR反应体系以后, 扩增效果出现了明显的改善；而未添加G5.NH2的阳性对照仍有大量的非特异性条带。当G5.NH2浓度小于1.05nM时，随着G5.NH2浓度的增加，非特异性条带逐渐减少甚至消失；值得注意的是，当加入的G5.NH2超过1.05nM后，纳米碳材料对PCR反应的影响也产生了类似于纳米金粒子的抑制作用即泳道6则没有出现任何条带。

图2-5. 加入不同浓度G5.NH2的扩增电泳图。

泳道M：Marker；泳道1~6中G5.NH2浓度依次为0、0.91、0.95、0.98、1.05、1.08nM；

泳道7为阴性对照。

PCR反应的效果应该从目标产物的产量和特异性两个方面来衡量，所以我们从产量和特异性的角度分别分析了各泳道的扩增效果，见图2-6。

如图2-6所示，当刚加入0.91nM的G5.NH2溶液时，目标产物的产量就得到了很大的提高。当G5.NH2的浓度小于1.05nM时，虽然加入的树状大分子浓度为0.98nM时，PCR扩增产率有所降低，但是当加入的G5.NH2的浓度逐渐增高的时候，目标产物的产量总体出现了逐渐升高的趋势。当G5.NH2的浓度为1.08nM时，PCR扩增受到抑制，PCR扩增效率为0。

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1.21.20.80.8 特异性效率0.40.40.00.920.961.001.041.080.0G5.NH2 的浓度(nM)图2-6. 不同浓度G5.NH2状大分子对扩增效率及特异性的影响

从特异性的角度来看，树状大分子材料溶液对再扩增体系起到了很好的优化效果，各条带的目标产物的特异性逐渐增大。当加入量为0.98nM~1.05nM时，扩增特异性近似为1，说明扩增结果基本为单一目标条带。当加入量超过1.05nM时，特异性遭到抑制。当G5.NH2的浓度为1.08nM时, 目标条带甚至已经消失。综合扩增效率和扩增特异性的参考，可以得出当G5.NH2加入量在0.95nM~1.05nM之间时，扩增效率比阳性对照有很大的提高，当浓度在0.98nM~1.05nM之间时，扩增特异性近似为1。当G5.NH2加入量为1.05nM时，既可以得到最大量的目标产物，且特异性最好。由此，我们认为1.05nM为G5.NH2优化再扩增体系的最佳优化浓度。 2.2.4 {(Au0) 25 -G5.NH2}对PCR优化的影响

实验结果说明{(Au0)25-G5.NH2}对PCR反应具有优化效果。从图2-7中可以看出, {(Au0)25-G5.NH2}作为添加剂加入到PCR反应体系以后, 扩增效果出现了明显的改善，随着添加剂的浓度的增加，非特异性的弥散逐渐消失；而未添加{(Au0)25 -G5.NH2}的阳性对照仍有大量的非特异性条带。当{(Au0)25-G5.NH2}浓度小于0.57nM时，随着{(Au0)25-G5.NH2}浓度的增加，非特异性条带逐渐减少甚至消失；值得注意的是，当加入的{(Au0)25-G5.NH2}超过0.57nM后，{(Au0)25 -G5.NH2}对PCR反应的影响也产生抑制作用，即泳道5中，目标条带变暗几乎看不到。

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图2-7. 不同浓度{(Au0)25 -G5.NH2}对PCR扩增的影响。

泳道M: Marker; 泳道1~5中{(Au0)25 -G5.NH2}浓度依次为0、0.40、0.45、0.51、0.57nM；

泳道6为阴性对照。

PCR反应的效果应该从目标产物的产量和特异性两个方面来衡量，所以我们从产量和特异性的角度分别分析了各泳道的扩增效果，见图2-8。

如图2-8所示，当刚加入0.40nM的{(Au0)25 -G5.NH2}溶液时，目标产物的产量就得到了很大的提高。当{(Au0)25 -G5.NH2}的浓度小于1.05nM时，虽然加入的浓度{(Au0)25 -G5.NH2}为0.51nM时，PCR扩增产率有所降低，但是当加入的{(Au0)25 -G5.NH2}的浓度逐渐增高的时候，目标产物的产量都要远远超高阳性对照组。当{(Au0)25 -G5.NH2}的浓度为0.57nM时，PCR扩增受到抑制，PCR扩增效率几乎为0。

1.21.0效率1.21.0特异性0.80.60.40.80.60.40.400.440.48 0.520.56{(Au0)25 -G5.NH2}浓度(nM)

图2-8. 不同浓度{(Au0)25 -G5.NH2}状大分子对扩增效率及特异性的影响

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

从特异性的角度来看，{(Au0)25-G5.NH2}溶液对再扩增体系起到了很好的优化效果，各条带的目标产物的特异性逐渐增大。当加入量为0.45nM~0.51nM时，扩增特异性近似为1，说明扩增结果基本为单一目标条带。当加入量超过0.51nM时，特异性遭到抑制。当{(Au0)25-G5.NH2}的浓度为0.57nM时, 目标条带甚至已经消失。

综合扩增效率和扩增特异性的参考，可以得出当{(Au0)25-G5.NH2}加入量在0.40nM~0.51nM之间时, 扩增效率比阳性对照有很大的提高，当浓度在0.45nM ~0.57nM之间时, 扩增特异性近似为1。当{(Au0)25-G5.NH2}加入量为0.51nM时，虽然既可以得到最大的特异性, 扩增效率也相对比较高量。由此，我们认为0.51nM为{(Au0)25-G5.NH2}优化再扩增体系的最佳优化浓度。 2.2.5 {(Au0) 50 -G5.NH2}对PCR优化的影响

实验结果说明{(Au0)50-G5.NH2}对PCR反应具有优化效果。从图2-9中可以看出, {(Au0)50-G5.NH2}作为添加剂加入到PCR反应体系以后, 扩增效果出现了明显的改善，随着添加剂的浓度的增加，非特异性的弥散逐渐消失；而未添加{(Au0)50-G5.NH2}的阳性对照仍有大量的非特异性条带。当{(Au0)50-G5.NH2}浓度小于0.49nM时，随着{(Au0)50-G5.NH2}浓度的增加，非特异性条带逐渐减少甚至消失；值得注意的是，当加入的{(Au0)50-G5.NH2}超过0.49nM后，{(Au0)50- G5.NH2}对PCR反应的影响也产生抑制作用，即泳道6目标条带消失。

图2-9. 不同浓度的{(Au0)50 -G5.NH2}对PCR扩增的影响。

泳道M：Marker；泳道1~6，{(Au0)50 -G5.NH2}浓度依次为0、0.35、0.40、0.45、0.49、

0.54nM；泳道7为阴性对照。

PCR反应的效果应该从目标产物的产量和特异性两个方面来衡量，所以我们从产量和特异性的角度分别分析了各泳道的扩增效果，见图2-10。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

如图2-10所示，当刚加入0.35nM的{(Au0)50-G5.NH2}溶液时，目标产物的产量就得到了很大的提高。当{(Au0)50-G5.NH2}的浓度大0.40nM时，PCR扩增产率有所降低，但是当加入的{(Au0)50-G5.NH2}的浓度逐渐增高的时候，目标产物的产量都要远远超高阳性对照组。当{(Au0)50-G5.NH2}的浓度为0.54nM时，PCR扩增受到抑制，目标条带消失。

1.0 率效1.0特异性 0.50.50.00.350.400.0{(Au0)50 -G5.NH2}浓度(nM)图2-10. 不同浓度{(Au0)50-G5.NH2}对扩增效率及特异性的影响

0.45 0.500.55

从特异性的角度来看，树状大分子材料溶液对再扩增体系起到了很好的优化效果，各条带的目标产物的特异性逐渐增大。当加入量为0.45nM~0.49nM时, 扩增特异性近似为1，说明扩增结果基本为单一目标条带。当加入量超过0.49nM时，特异性遭到抑制。当{(Au0)50-G5.NH2}的浓度为0.54nM时, 目标条带已经消失。

综合扩增效率和扩增特异性的参考，可以得出当{(Au0)50-G5.NH2}加入量在0.53nM~0.51nM之间时，扩增效率比阳性对照有很大的提高，当浓度在0.49nM时，扩增特异性为1。当{(Au0)50-G5.NH2}加入量为0.49nM时，虽然既可以得到最大的特异性, 扩增效率也相对比较高。由此, 我们认为0.49nM为{(Au0)50- G5.NH2}优化再扩增体系的最佳优化浓度。 2.2.6 {(Au0) 75 -G5.NH2}对PCR优化的影响

实验结果说明{(Au0)75-G5.NH2}对PCR反应具有优化效果。从图2-11中可以看出, {(Au0)75-G5.NH2}作为添加剂加入到PCR反应体系以后, 扩增效果出现了明显的改善，随着添加剂的浓度的增加，非特异性的弥散逐渐消失；而未添加

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

{(Au0)75-G5.NH2}的阳性对照仍有大量的非特异性条带。当{(Au0)75-G5.NH2}浓度小于0.51nM时，随着{(Au0)75-G5.NH2}浓度的增加，非特异性条带逐渐减少甚至消失；值得注意的是，当加入的{(Au0)75-G5.NH2}超过0.51nM后，{(Au0)75-G5. NH2}对PCR反应的影响也产生抑制作用，即泳道5目标条带消失。

图2-11. 不同浓度{(Au075)-G5.NH2}对PCR扩增的影响。

泳道M: Marker; 泳道1~5, {(Au0)75-G5.NH2}浓度依次为0、0.39、0.45、0.51、0.57nM；

泳道6阴性对照。

PCR反应的效果应该从目标产物的产量和特异性两个方面来衡量，所以我们从产量和特异性的角度分别分析了各泳道的扩增效果，见图2-12。当刚加入0.39nM的{(Au0)75-G5.NH2}溶液时，目标产物的产量就得到了很大的提高。当{(Au0)75-G5.NH2}的浓度大于0.45nM时，PCR扩增产率有所降低，但是当加入的{(Au0)75-G5.NH2}的浓度低于0.45nM时, 随着{(Au0)75-G5.NH2}浓度逐渐增高，目标产物的扩增效率越来越高。当{(Au0)75-G5.NH2}的浓度为0.57nM时，PCR扩增受到抑制，目标条带消失。

从特异性的角度来看，树状大分子材料溶液对再扩增体系起到了很好的优化效果，各条带的目标产物的特异性逐渐增大。当加入量为0.45nM~0.51nM时, 扩增特异性为1，扩增产物为单一目标条带。当加入量超过0.51nM时，特异性遭到抑制。当{(Au0)75 -G5.NH2}的浓度为0.57nM时, 目标条带已经消失。

综合扩增效率和扩增特异性的参考，可以得出当{(Au0)75-G5.NH2}加入量在0.51nM时，扩增效率比阳性对照有很大的提高，尤其当浓度在0.45nM时，扩增特异性为1。可见，当{(Au0)75-G5.NH2}加入量为0.45nM时，既可以得到最大量的目标产物，且特异性最好。因此，我们认为0.45nM为{(Au0)75-G5.NH2}优化再扩增体系的最佳优化浓度。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

1.21.20.8效率0.8特异性 0.40.40.00.400.450.0{(Au0)75 -G5.NH2}浓度(nM)图2-12. 不同浓度{(Au0)75 -G5.NH2}对扩增效率及特异性的影响

0.500.55

从特异性的角度来看，树状大分子材料溶液对再扩增体系起到了很好的优化效果，各条带的目标产物的特异性逐渐增大。当加入量为0.45nM~0.51nM时，扩增特异性为1，扩增产物为单一目标条带。当加入量超过0.51nM时，特异性遭到抑制。当{(Au0)75 -G5.NH2}的浓度为0.57nM时, 目标条带已经消失。

2.2.7 {(Au0) 100 -G5.NH2}对PCR优化的影响

实验结果说明{(Au0)100-G5.NH2}对PCR反应具有优化效果。从图2-13中可以看出, {(Au0)100-G5.NH2}作为添加剂加入到PCR反应体系以后, 扩增效果出现了明显的改善，随着添加剂的浓度的增加，非特异性的弥散逐渐消失；而未添加{(Au0)100-G5.NH2}的阳性对照仍有大量的非特异性条带。当{(Au0)100-G5.NH2}浓度小于0.43nM时，随着{(Au0)100-G5.NH2}浓度的增加，非特异性条带逐渐减少甚至消失；值得注意的是，当加入的{(Au0)100-G5.NH2}超过0.43nM后，{(Au0)100- G5.NH2}对PCR反应的影响也产生抑制作用，即泳道5目标条带消失。

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图2-13. 不同浓度的{(Au0)100 -G5.NH2}对PCR扩增的影响。

泳道M：Marker；泳道1~5中{(Au0)100 -G5.NH2}浓度依次为0、0.31n、0.37、0.43、0.49nM；

泳道6为阴性对照

PCR反应的效果应该从目标产物的产量和特异性两个方面来衡量，所以我们从产量和特异性的角度分别分析了各泳道的扩增效果，见图2-14。

如图2-14，当刚加入0.31nM的{(Au0)100-G5.NH2}溶液时，目标产物的产量就得到了很大的提高。当{(Au0)100-G5.NH2}的浓度大于0.31nM时，PCR扩增产率随着{(Au0)100-G5.NH2}浓度的增加而降低。当{(Au0)100-G5.NH2}的浓度为0.49nM时，PCR扩增受到抑制，目标条带消失。

1.21.2效率0.80.8特异性0.40.40.00.300.350.400.450.00.50{(Au0)100 -G5.NH2}浓度(nM)

图2-14. 不同浓度{(Au0)100 -G5.NH2}对扩增效率及特异性的影响

综合扩增效率和扩增特异性的参考，可以得出当{(Au0)100-G5.NH2}加入量在

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0.31nM时，扩增效率比阳性对照有很大的提高，尤其当浓度在0.37nM时，扩增特异性为1。可见，当{(Au0)100-G5.NH2}加入量为0.37nM时，既可以得到最目标产物的特异性，并且其扩增效率也相对较高。因此，我们认为0.37nM为{(Au0)100 -G5.NH2}优化再扩增体系的最佳优化浓度。 2.2.8 {(Au0) 125 -G5.NH2}对PCR优化的影响

实验结果说明{(Au0)125-G5.NH2}对PCR反应没有优化效果。从图2-15中可以看出, {(Au0)125-G5.NH2}作为添加剂加入到PCR反应体系以后, 扩增效果没有改善。虽然随着添加剂的浓度的增加，非特异性的弥散逐渐消失，但是283bp目标条带没有扩增出来。当{(Au0)125-G5.NH2}浓度为0.37nM时，非特异的弥散条带更加明亮并且目标条没有扩增出来。值得注意的是，当加入的{(Au0)125-G5.NH2}超过0.31nM后，{(Au0)125-G5.NH2}对PCR反应的影响也产生抑制作用，即泳道3目标条带消失。

图2-15. 不同浓度{(Au0)125 -G5.NH2}对PCR扩增的影响。

泳道M: Marker; 泳道1~5, {(Au0)125-G5.NH2}浓度依次为0.31、0.37、0.43、0.49nM;

泳道6阴性对照。

2.2.9 结论

通过半定量分析，计算出不同Au DENPs的优化效率和特异性(表2-1)。我们发现Au与G5.NH2摩尔比为25、50、75、100的Au DENPs都可以提高再扩增体系的PCR扩增的特异性和效率。Au DENPs对再扩增体系的优化要好于不包金的第五代的PAMAM树状大分子，它们的最优浓度都低于0.51nM，比G5.NH2的最优浓度(1.05nM)的一半还要低。随着Au与G5.NH2摩尔比的增高，它们的最优浓度越来越低，{(Au0)25-G5.NH2}, {(Au0)50-G5.NH2}, {(Au0)75-G5.NH2}和{(Au0)100

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-G5.NH2}的最优浓度分别为0.51nM, 0.49nM, 0.45nM和0.37nM。

表2-1. 不同Au DENPs的最优浓度，最大效率和特异性

添加剂 G5.NH2 {(Au0)25-G5.NH2} {(Au0)50-G5.NH2} {(Au0)75-G5.NH2} {(Au0)100-G5.NH2}

最优浓度 1.05nM 0.51nM 0.49nM 0.45nM 0.37nM

最大效率 1.4 1.1 1.1 1.1 0.9

最大特异性

1 1 1 1 1

上述试验结果表明，随着胶体金与G5.NH2的摩尔比增大，裸露在树状大分子表面的氨基越来越大，相应树状大分子的最佳优化浓度减小，即PCR反应只需要更少的树状大分子来达到其最佳优化效果(如图2-16)。据我们推断，Au DENPs的优化机制是胶体金的加入使树状大分子的“硬度”增大，当树状大分子与PCR各组分相互作用时，由于其表面的有效反应基团增多，提高周围PCR各组分有效反应浓度以及促使游离的聚合酶越来越倾向于与完全配对的引物和模板形成复合物的能力得到增强，从而增强反应的效率及特异性。

1.0最优浓度(nM)0.8 0.60.40255075100

Au/G5.NH2摩尔比

图2-16. 不同硬度的树状大分子与最佳优化浓度之间的函数关系。

就目前已有的文献报道和实验数据，可以对纳米材料在PCR优化作用的机制，提出这样一些初步的假设。但是我们需要清楚的是，PCR反应是一个动态的过程，并且体系中所包含的各组分之间的关系很复杂，比如说体系中Mg2+的浓度就需要考虑到聚合酶，dNTP，模板DNA等各个因素。所以，我们还需要更

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多的工作，来最终找到一个合理的机制 2.2.10 非特异体系的构建

为了进一步验证我们的推论，我们又采用了非特异性扩增测试体系来验证我们的试验结果。Thy-1基因是以大鼠尾巴的基因组DNA为模板扩增出来的一个基因片段，在实验过程中，我们用引物1和引物2来扩增Thy-1基因片段。从图中，我们可以发现1026bp的目标条带没有扩增出来只有一些非特异性弥散的片段。虽然随着模板浓度从10ng增加到500ng，非特异性条带越来越亮，但是目标条带仍然没有出现，与先前文献提到的非特异扩增体系不同[61]，可能由于大鼠尾基因购买与不同公司。

图2-17. 不同模板浓度对Thy-1基因扩增的影响。

泳道1-8, 模板浓度分别为10ng, 50ng, 100ng, 200ng, 300ng, 400ng, 500ng, 0ng.

2.2.11 不同Au DENPs对非特异性体系扩增的影响

我们选择400ng的大鼠尾基因组DNA作为模板来验证G5.NH2和Au DENPs是否可以优化PCR。对于同一个材料, 我们选择了一系列浓度范围来检验它是否能够提高PCR的特异性和效率。我们通过溴化乙啶染色的琼脂糖凝胶电泳来检测PCR产物。

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图2-18. G5.NH2对PCR扩增特异性的影响。

泳道1-9, G5.NH2 的浓度分别为13.4、14.9、44.6、74.4、104.2、133.9、148.8、446.4nM; 泳

道10为阴性对照。

图2-19. {(Au0)25-G5.NH2}对PCR扩增特异性的影响。

泳道1-9, {(Au0)25 -G5.NH2}的浓度为0, 11.8, 13.1, 39.2, 65.3, 91.4, 117.5, 130.6, 261.2nM; 泳

道10为阴性对照。

图2-20. {(Au0)50-G5.NH2}对PCR扩增特异性的影响。

泳道1-11, {(Au0)50 -G5.NH2}的浓度分别为0, 5.91、8.28、10.64、11.82、35.5、59.1、82.8、

106.4、118.2、354.7nM; 泳道12为阴性对照

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图2-21. {(Au0)75 -G5.NH2}对PCR扩增特异性的影响。

泳道1-8, {(Au0)75-G5.NH2}的浓度分别为0、8.38、9.32、27.95、65.2、83.9、93.2、279.5nM；

泳道9为阴性对照。

图2-22. {(Au0)100 -G5.NH2}对PCR扩增特异性的影响。

泳道1-9, {(Au0)100-G5.NH2}的浓度分别为9.36、28.1、46.8、65.5、84.2、93.6、280.8、468nM；

泳道10为阴性对照。

图2-23. {(Au0)125-G5.NH2}对PCR扩增特异性的影响。

泳道1-8, {(Au0)125-G5.NH2}的浓度分别为0、8.9、26.8、44.6、62.5、80.4、267.8、446.4nM；

泳道9为阴性对照。

根据图18-23，我们发现G5.NH2和摩尔比为25、50、75、100、125的Au DENPs也可以优化非特异性PCR测试体系。尽管添加剂添加到PCR反应非特异体系后仍然有一些弥散和非特异性条带存在，但是将Au DENPs添加到非特异扩增反应体

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系后，1026bp的DNA目标条带被扩增出来。当Au与G5.NH2的摩尔比小于100时，随着添加剂的浓度增加目标条带越来越明亮。{(Au0)125-G5.NH2}的最低优化浓度高于{(Au0)125-G5.NH2}，这是因为Au与G5.NH2的摩尔比大于100时，Au DENPs的合成需要更多的G5.NH2包裹，{(Au0)125-G5.NH2}表面的氨基少于{(Au0)100-G5. NH2}。因此，与PCR反应组分相互作用的表面氨基减少，{(Au0)125-G5.NH2}的优化效率降低。通过半定量分析每种添加剂的特异性和效率(表2-2)，我们发现于G5.NH2的优化效果相比，Au DENPs的优化效果更好一些。随着胶体金与G5.NH2的摩尔比增大，相应树状大分子的最佳优化浓度减小，这与再扩增体系的结论相同。

表2-2. G5.NH2和不同Au DENPs的最优浓度、最大效率和最大特异性。

添加剂 G5.NH2 {(Au0)25-G5.NH2} {(Au0)50-G5.NH2} {(Au0)75-G5.NH2} {(Au0)100-G5.NH2} {(Au0)125-G5.NH2}

最优浓度 446.4nM 130.6nM 106.4nM 65.2nM 28.1nM 62.5nM

最大效率 1.36 1.14 1.28 1.03 1.14 0.98

最大特异性

0.39 0.49 0.52 0.37 0.36 0.15

根据上述结果，我们可以得出与再扩增体系相同的结论随着胶体金与G5.NH2的摩尔比增大，相应树状大分子的最佳优化浓度减小，即PCR反应只需要更少的树状大分子来达到其最佳优化效果。从中，我们可以尝试探讨其中存在的优化规律。

2.3 Au DENPs与BSA作用结果

由于商品化DNA聚合酶价格昂贵，而且其组分比较复杂，这对于清楚研究纳米材料与蛋白质的相互作用存在一定的困难。BSA是一种重要的模式蛋白[62]，分子量为64kD，粒径约为7.0nm，经常用来研究蛋白与纳米材料的相互作用，，因此我们选择用BSA代替商品化DNA聚合酶研究与胶体金的相互作用。

根据上述实验结果我们推论，Au DENPs优化PCR的分子机理是Au DENPs的表面氨基与PCR反应体系各组分相互作用，从而提高了反应体系的相对浓度, 树状大分子与蛋白质或DNA之间的作用可能会影响扩增结果。我们猜测如果Au DENPs与单链或双链的DNA之间的相互作用是主要因素，由于DNA很小, Au DENPs颗粒大小在与DNA作用前后颗粒大小不会发生变化。如果Au DENPs与BSA蛋白作用之间的相互作用是主要因素，PCR扩增前后颗粒大小会变大。因此，

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

我们通过探讨Au DENPs与BSA蛋白相互作用前后颗粒的大小，从而探索Au DENPs优化PCR的作用机制。

40 BSA30Volume (%)10005101520

Diameter (nm)图2-24. BSA颗粒大小

40 G5.NH2+BSA {(Au)50-G5.NH2}+BSA0Volume (%)301000200400600800

Diameter (nm)

图2-25. G5.NH2和{(Au0)50-G5.NH2}与BSA作用后;颗粒大小的变化。

由图2-24可以看出，BSA在PCR buffer中可以均匀分散，粒径约为7.37nm。BSA与dendrimer作用一段时间后，粒径分布会发生了一些变化：将BSA与G5.NH2作用后，检测峰均出现在300nm左右。G5.NH2表面为氨基带正电荷[58]，

20 20不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

与带负电的BSA能形成强烈的静电吸引作用，所以BSA与G5.NH2或(Au0)51.2-G5.NH2作用后发生聚集，形成了大的聚合物；(Au0)51.2-G5.NH2的Zeta电位为+36.86mV[63]，与与带负电的BSA作用后，粒径约为400nm左右，远远大于G5.NH2与BSA作用后的颗粒大小(图2-25)。只是因为G5.NH2分子比较柔软，易吸附在物质的表面，所以其吸附的BSA分子有限，无法形成较大的聚合物；G5.NH2分子中加入胶体金后，表面有效接触面积明显增大，可以同时与多个BSA蛋白分子作用，所以粒子的粒径明显增大，甚至出现聚合物。这些结果再次说明，dendrimer表面电荷电量及分子本身的硬度对于dendrimer与PCR组分的作用有非常重要的影响。

2.4 讨论

上述的实验结果显示，树状大分子以及Au DENPs都具有很好的优化效果，它们能够很好地优化PCR反应的特异性扩增，而且优化用量比较稳定。在我们的实验中存在的唯一变量就是树状大分子所包裹的胶体金浓度的不同，随着包裹胶体金浓度的增加，树状大分子暴露在表面的基团数目发生改变，其“硬度”逐渐增强。不过，包裹胶体金的树状大分子的物理化学性质与其所对应的树状大分子相比基本相同，并没有因为分子中含有胶体金而发生改变。由于树状大分子本身非常柔软，当其与其他物质相互作用时会吸附到物质的表面，形成平的饼状结构，减少了作用位点并增大了空间位阻，从而影响其与更多的物质的进一步作用。而一旦树状大分子包裹有胶体金以后，其形状发生了一定的改变，由饼状向球形发展，且包裹的胶体金越多，越接近球形，而在其变圆的过程中，其表面更多的氨基被暴露出来，由于表面氨基是树状大分子其催化作用的重要结构，所以被认为包裹有纳米金能够使其与其他物质相互作用时有效接触面积增大，见图3-13。

氨基基团作为树状大分子发挥催化作用的重要结构，其本身带正电荷，从而使树状大分子也带有正电荷。Bielinska等人对DNA/树状大分子复合物进行了研究，发现DNA结合到阳离子树状大分子上后似乎改变了DNA的结构。因此，阳离子树状大分子与DNA之间的相互作用可能会破坏DNA双链结构，从而导致碱基和引物更准确的与模板配对，进而使扩增更具特异性以及更高效。在这种情况下，每个树状大分子的氨基基团将与DNA产生更强的相互作用，进而只需要更少的树状大分子用以优化PCR反应。

PCR反应体系非常复杂，包含有各种分子，如双链DNA模板、聚合酶、dNTP、单链DNA引物等。据我们猜测，树状大分子加入到反应体系后能同时与模板、引物、酶作用。首先，树状大分子与PCR各组分相互作用提高了其周围PCR组分的浓度，从而增加了扩增反应的可能性，提高扩增效率。其次，在因为退火或延

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

伸阶段“引物-酶-模板”复合物形成的时候，树状大分子可能与模板、引物、酶间存在竞争作用。树状大分子的加入促使游离的聚合酶越来越倾向于与完全配对的引物和模板形成复合物，从而增强反应的特异性。当这种趋势占绝对优势时，就达到其最佳优化浓度。

图2-26. G5.NH2(a)和Au DENPs(b)与PCR体系组分相互作用示意图。

然而由于树状大分子优化PCR反应的细节必定十分复杂，对于其更进一步的优化机制我们暂时并不十分清楚，而其深入机制也正在继续研究中，相信不久的将来能够得到令人满意的结果。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

第三章聚乙烯亚胺修饰的不同表面电荷多壁碳纳米管对

PCR优化的影响

目前, 对于纳米材料优化PCR作用机制的解释主要有三种理论：纳米颗粒改善PCR体系的热传导性，纳米颗粒与单链DNA结合，纳米颗粒与聚合酶结合。 (1) 纳米颗粒改善PCR体系的热传导性

有研究指出通过添加纳米颗粒可以改善水和油的传热性质[19]。这对优化PCR可能有一定的作用。因为通过观察PCR的整个程序，可以发现PCR反应分为变性、退货、延伸三个阶段，每个阶段所需要的温度各不相同，甚至差距很大，这对PCR仪器在各温度之间的转化效率提出了一定的要求。

李明等人[19]在2005年发表的文章中，就提到了这个可能性，他们认为纳米颗粒的作用为改善快速升/降温体系PCR的热传导性, 从而有利于模板和引物更高效地配对。并且通过实验证明了，添加纳米颗粒后，PCR反应的扩增效率得到了提高。

而且需要指出的是对于PCR反应来说，退火温度的影响很大。一般来说降低退火温度可提高扩增产量，但引物与模板间错配现象会增多，导致非特异性扩增上升；若提高退火温度可减少引物与模板间的非特异形结合从而提高反应的特异性，但扩增效率下降。所以如果加入纳米金颗粒后的PCR体系，变性温度到退火温度间的热转化效率有所提高，那么也许可以作为特异性增强的一个解释原因。

(2) 纳米颗粒与单链DNA结合

李海阔等人[18]于2005年提出纳米金颗粒可产生类似单链结合蛋白(SSB)的效果而提高PCR的特异性。

单链结合蛋白(SSB)是一种与单链DNA紧密结合的蛋白质，在扩增过程中它直接结合在单链的DNA上，而不会结合在双链的DNA上。它的特异性可以非常显著的减少在扩增过程中的引物与模板的错配，作用如图3-8所示。

SSB蛋白

图3-1. SSB蛋白与单链DNA结合示意图

模板DNA

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

与SSB相联系，纳米颗粒与单链DNA结合的能力远好于结合双链DNA的能力。虽然尚未完全理解，但是人们逐渐发现了一些纳米颗粒选择性与单链DNA相结合的原理。首先，从静电学的角度来看，表面带负电荷的DNA链与表面同样带有负电荷的纳米颗粒是有排斥作用的。但是我们需要注意的是单链DNA的排斥作用远小于双链DNA的排斥作用。其次，四种碱基—腺嘌呤，鸟嘌呤，胞嘧啶，胸腺嘧啶(A,G,C,T)所含有的氮原子对纳米颗粒有很强的结合能力。双链DNA的结构阻止了四种碱基与纳米金颗粒的结合作用。最后，双链DNA的结构产生的刚度，使得其不能与纳米颗粒环绕着结合，而单链DNA相对而言是一种“柔软”的聚合物，可以紧密地与纳米颗粒环绕结合。 (3) 纳米颗粒与聚合酶结合

聚合酶的活性和浓度对PCR技术来说非常重要。实验室中一般使用的是Taq酶，它的活性对Mg2+、K+、NH4+等离子的浓度较敏感，其中受Mg2+浓度的影响最大。

米丽娟等人[64]在2007年发表的文章中，指出纳米颗粒与聚合酶存在一定的作用关系，并且重点解释了过量浓度的纳米颗粒对PCR反应产生抑制作用的机制。

在实验中，他们向正常情况下被纳米颗粒抑制的PCR体系中加入了过量的DNA聚合酶，结果显示可以消除纳米颗粒对扩增的抑制作用，如图3-9所示。同时他们也尝试了向被抑制的PCR体系中，加入过量的其他成分，如引物，模板等，但是发现效果没有加入过量DNA聚合酶的作用好。据此他们认为，纳米的抑制主要源于聚合酶的相互作用, 加入聚合酶是最有效的缓解方式。并且提出了纳米调控聚合酶的机制假说。

图3-2. DNA 聚合酶消除纳米金对扩增的抑制

泳道1～5 是聚合酶为2.5 U 的扩增结果, 纳米金的浓度从左至右依次为0, 0.4, 0.8, 1.2 与

1.6nM; 泳道6 是分子量标准DL2000

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

为了揭示PCR优化机制，不同表面电荷修饰的各种多壁碳纳米管被合成并且

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

做为优化剂。我们以不同表面电荷为参考参数，来探讨不同表面电荷对PCR优化作用的影响。

3.1 材料与方法

3.1.1 实验试剂

多壁碳纳米管 (直径 = 30-70nm, 长度= 100 nm-2μm) 根据本课题组报道的文献的合成与表征[65]。多壁碳纳米管（MWCNTs）在HNO3/H2SO4 (v/v = 3:1)中浸泡两个小时，然后经过过滤干燥得到表面修饰羧基的多壁碳纳米管。多支状的聚乙烯亚胺 (Mw = 25,000), 乙酸酐, 琥珀酸酐和其他的化学药品和试剂都从Aldrich化学试剂公司购买。本实验所用的水为无菌超纯水。 3.1.2 实验材料

酸处理的多壁碳纳米管(直径= 30-70nm, 长度= 100 nm-2μm), EI修饰的多壁碳纳米管(CNT/PEI), 酰化后的PEI修饰的多壁碳纳米管(CNT/PEI.Ac), 羧基化PEI修饰的多壁碳纳米管(CNT/PEI.SAH)。

图3-3. MWCNTs, CNT/PEI, CNT/PEI.Ac和CNT/PEI.SAH的结构示意图。

3.2结果与讨论

3.2.1 不同表面修饰的碳纳米管对PCR优化的影响

将带不同表面电荷修饰的碳纳米管(表3-1)添加到再扩增PCR检测体系后,

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

我们可以清楚的看到酸处理后带负电荷的MWCNTs(图3-5a), 带正电荷的CNT/PEI (图3-5b)和带负电荷的CNT/PEI.SAH (图3-5d)都可以提高再扩增体系的特异性和效率。然而, 电中性的CNT/PEI.Ac不能够优化该PCR扩增体系(图3-5c)。当添加MWCNTs、CNT/PEI、CNT/PEI.SAH的浓度低于最优浓度时，添加到再扩增PCR反应体系后，283bp的目标条带被扩增出来，并且随着添加剂浓度的增加目标条带的亮度和密度增加，非特异性条带和弥散减弱甚至消失。然而，当它们的浓度高于最优浓度时，目标条带和非特异性产物都被抑制。这些现象是与传统的PCR优化剂相同的，与先前的报道也是相符的[22]。

表3-1. 功能化的MWCNTs的表面电势

添加剂表面电势

(mV)

MWCNTs -45.6

CNT/PEI +34.6

CNT/PEI · A

c -0.756

CNT/PEI ·SA

-20.6

当不同表面电荷修饰的碳纳米管作为添加剂时，PCR优化效果是明显不同的。酸处理的MWCNTs，表面带正电荷的CNT/PEI和带负电荷的CNT/PEI.SAH在不同的浓度范围内优化PCR。然而,电中性的CNT/PEI.Ac不能优化PCR，这可能是由于它不能与PCR反应组分(e.g. dsDNA, 模板, DNA聚合酶, dNTP, ssDNA, 引物等等)有效的结合形成复合物造成的。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

图3-4. 不同表面修饰的碳纳米管对PCR优化的影响.

泳道M是marker; 最后一个泳道为阴性对照。(a) 酸处理的MWCNTs, 泳道1-6, 最终浓度分别为 0, 15.52, 23.28, 31.04, 38.80, 46.56 mg/L。 (b) CNT/PEI, 泳道1-6, 最终浓度分别为0, 0.17, 0.22, 0.28, 0.39, 0.44mg/L。 (c) CNT/PEI.Ac, 泳道1-5, 最终浓度分别为0, 6.19, 18.57, 30.95, 43.34 mg/L。(d) CNT/PEI.SAH, 泳道1-6, 最终浓度分别为0, 0.54, 0.63, 0.78,

0.82, 0.86 g/L。

WCIF ImageJ软件对扩增效果图进行半定量分析PCR的特异性和效率(表3-2)，我们发现酸处理的MWCNTs的最优浓度为23.28mg/L, CNT/PEI 为0.39 mg/L, CNT/PEI·SAH为0.63g/L；最优效率分别为1.18, 1.46, 2.24；最大PCR特异性都为1。尽管CNT/PEI.SAH具有最高的PCR效率，但是它的最优浓度是CNT/PEI最优浓度的103倍。

酸处理的MWCNTs和带负电荷的CNT/PEI.SAH也可以优化PCR也是一个很有趣的现象。一般认为，由于静电排斥作用，带负电的聚合物或纳米颗粒不能与DNA形成复合物。但是，羧基化的碳纳米管可以作为一个支架通过氢键、疏水作用和范德华力从而浓缩PCR体系中各组分的相对浓度。根据试验结果，我们推论：带负电荷的碳纳米管与DNA之间的作用要弱于带正电荷的CNT/PEI 与DNA之间的作用。因此，带负电荷的碳纳米管的优化作用比带正电荷的CNT/PEI弱，酸作用的MWCNTs和CNT/PEI.SAH的最优浓度都要高于CNT/PE。尽管酸处理的MWCNTs和CNT/PEI.SAH都带负电荷，但是CNT/PEI.SAH的最优浓度要比酸作用的MWCNTs的最优浓度高一倍多，这可能因为在PCR反应过程中，CNT/PEI.SAH的胶体稳定性比较差引起的。

表3-2. 添加剂的效率、特异性及最优浓度

添加剂最优浓度 (mg/L) 最大效率最大特异性

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

CNT/PEI MWCNTs CNT/PEI·SAH

PEI

0.39 23.28 630.00 0.076

1.46 1.18 2.24 1.14

1 1 1 1

PEI是一种多支状的聚阳离子合成聚合物。在基因传递中广泛应用，它能与DNA形成一种稳定的聚合物[66]。带正电荷的CNT/PEI也可以与DNA形成稳定的聚合物，从而使双链DNA的结构更加稳定。因此，引物与模板的配对更加准确，PCR扩增的特异性和效率提高。另外，大部分的PCR组分(dsDNA 模板, DNA聚合酶, dNTP, ssDNA ,引物等)都可以强烈的与CNT/PEI发生作用，提高PCR各组分的相对浓度，从而提高PCR扩增的特异性和效率。

图3-6. PEI对PCR优化的影响。

泳道M为marker; 泳道7为阴性对照; 泳道1-6, PEI的最终浓度为0, 46.2, 57.7, 69.2,

76.2和80.8 μg/L。

在优化再扩增PCR体系时，PEI修饰后的MWCNTs表面带有正电荷使得CNT/PEI具有较高的效率。为了进一步证明PEI在优化PCR中起到的关键作用，我们将PEI作为一种添加剂，图3-6是PEI在不同浓度下对PCR优化的影响。我们看到PEI的优化作用与CNT/PEI相似。PEI的最优化浓度是0.076 mg/L，最大效率和最大特异性分别为1.14和1(表3- 1)。不同表面电荷修饰的碳纳米管可以优化PCR和PEI在碳纳米管不作为添加剂时的高效优化效率的事实表明：碳纳米管的热传导性并不是PCR优化机制的主要机理，与以前的报道不符[22]。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

3.2.2 退火温度对PCR扩增的影响

为了进一步验证我们的假设碳纳米管介导的热传导作用并不是PCR优化的关键机制，我们探讨了在不同退火温度下(50.0, 42.4, 34.4和 30.0℃) PEI和PEI修饰的碳纳米管对PCR扩增的影响。如果热传导作用起关键的作用，PCR扩增一定会受到影响。正如图3-7所示，将添加物加入到PCR反应体系中后，即使退火温度低到30℃，我们仍能得到目标条带。然而，当没有任何添加剂时，一般的PCR只出现一些弥散没有目标条带。虽然CNT/PEI和PEI都可以优化PCR，但是他们的最优浓度要远远小于MWCNTs的最优浓度。根据这些试验结果, 我们可以推出CNT/PEI的优化作用不仅仅是因为碳纳米管的良好热分散性, 也跟PCR各组分与CNT/PEI的表面正电荷的相互作用有关并且起到了主要作用。

图3-7. 退火温度对PCR特异性的影响。

泳道M是marker; 泳道1-5相对应的温度分别是 55.0, 50.0, 42.4, 34.4和 30.0℃; 泳道6是阴性对照。(a)没有添加剂时，PCR的扩增结果; (b), (c), (d)分别表示MWCNTs, CNT/PEI

和PEI在最优浓度下对PCR的影响。

3.2.3 延伸时间对PCR扩增的影响

为了进一步验证碳纳米管介导的热传导性在PCR优化过中的作用是几乎可

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

以忽略的，我们检测了延伸时间对PCR优化作用的影响。PCR程序包括30个循环，98℃变性, 60℃退火15s, 最后72℃ 诱导5min。试验结果表明由于PCR反应体系中添加了MWCNTs, CNT/PEI和PEI之后, PCR优化所需要的循环时间明显减少(图3-8)。例如, 再扩增体系热循环需要70min。但是，加入添加剂后热循环只需要30min就可以达到优化效果。这表明，PCR优化作用不仅仅是由于碳纳米管的热传导性，更重要的是PCR反应组分与PEI或CNT/PEI之间的相互作用。不同表面电荷修饰的碳纳米管，在较短的延伸时间仍能达到优化PCR的试验结果，有力的证明了我们对PCR机制的推断。

图3-8. 延伸时间对PCR的影响。

泳道M是 marker. 泳道1是阳性对照; 泳道 2, 3和4分别表示MWCNTs, CNT/PEI和PEI的

结果;泳道5是阴性对照。

3.3 结论

总之，我们应用酸处理的带负电荷的MWCNTs和三种PEI修饰的带不同电荷的碳纳米管作为添加剂去探讨它们对PCR扩增的特异性和效率的影响。我们得到的试验结果表明：当CNT/PEI加入PCR反应体系后，它可以有效的提高再扩增体系的特异性及效率。然而，电中性的CNT/PEI.Ac不能优化该体系。尽管带负电荷的CNT/PEI.SAH可以优化PCR，但是它的最优浓度要远远高于带正电荷的CNT/PEI。PEI修饰的碳纳米管的表面电荷对PCR的优化起至关重要的作用；在碳纳米管不是添加剂时，降低退火温度和缩短延伸时间都可以优化PCR扩增。这些试验结果表明PEI和CNT/PEI表面所带的正电荷和PCR组分之间的电荷作用在优化PCR的过程中起到了关键的作用。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

第四章结论

本文的工作主要可以总结为两大部分，第一部分为探索树状大分子包裹的金纳米颗粒在再扩增体系和非特异体系中的作用，通过反复试验收集实验数据来完成。采取了用光子相关谱法分，对树状大分子包裹的金纳米颗粒与BSA之间的相互作用关系进行了初步探索。

第二部分为对PEI修饰的不同表面电荷的碳纳米管在再扩增体系PCR优化中的机制进行探讨。通过采用不同的PCR退火温度和延伸时间来探讨碳纳米管的热传导性在PCR优化中是否起到关键作用。

在第一部分中，不同摩尔比的Au DENPs分别在再扩增体系和非特异扩增体系中进行了实验。实验结果表明，Au与G5.NH2摩尔比为25、50、75, 100的Au DENPs都可以提高再扩增体系的PCR扩增的特异性和效率，Au DENPs对再扩增体系的优化效果要好于G5.NH2。随着胶体金与G5.NH2的摩尔比增大，裸露在树状大分子表面的氨基越来越大，相应树状大分子的最佳优化浓度减小，即PCR反应只需要更少的树状大分子来达到其最佳优化效果。我们采取用光子相关谱法，对Au DENPs与BSA蛋白之间的相互作用关系进行了初步探索。结果表明Au DENPs与BSA蛋白有强烈的相互作用。

本文的第二部分对PEI修饰的不同表面电荷的碳纳米管在再扩增体系

PCR优化中的机制进行探讨。通过采用不同的PCR退火温度和延伸时间来探讨碳纳米管的热传导性在PCR优化中是否起到关键作用。试验结果表明，表面修饰正电荷和负电荷的碳纳米管可以优化再扩增体系的PCR扩增，表面被乙酰化的碳纳米管没有优化作用。当退火温度降低至30.0℃，PCR扩增时间缩短到30min时，表面修饰正电荷和负电荷的碳纳米管仍然可以优化PCR扩增反应。这些试验结果表明热传导在PCR优化作用中并没有起到主导作用，表面电荷与PCR反应组分的相互作用起到了关键作用。

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硕士研究生阶段发表论文

[1] Effect of dendrimer-entrapped gold nanoparticles on the polymerase chain react- ion. 中国国际纳米科技研讨会，会议论文，已接收（该论文将被纳米科技杂志收录），第一作者。

[2] Effect of Surface Charge of Polyethyleneimine-Modified Multiwalled Carbon Nanotubes on the Improvement of Polymerase Chain Reaction. Nanoscale, submitted, 第一作者。

不同纳米材料对PCR的优化作用的研究及机制探讨

致谢

在这里要首先感谢我的导师—史向阳教授！感谢史老师在课题研究中对我的指导和帮助！史老师在课题设计上的具有前瞻性的意见给我指明了方向。在随后的研究中，每当遇到解决不了的困难，史老师总是会提供精心的指导和意见。

感谢曹雪雁沈明武老师，郭睿老师，和沈明武老师的关心和帮助！在平日的科研工作中，总会得到各位老师的指导和帮助！特别是对于很多实验中的具体问题，总会得到细致的帮助！

感谢刘福娟，肖仕丽，齐瑞岭师姐的帮助!尤其是在刚进实验室的那段时间，得到了师姐们的这种帮助，使我得以较快进入课题！

感谢同届的刘辉，方旭，廖辉辉，王寅，彭琛，王世革同学！大家的互相帮助，互相鼓励，为课题组营造了良好的科研氛围，使我受益匪浅！也要感谢各位师弟师妹的帮助！

最后，感谢国家自然科学基金，国家973计划子课题，上海市高校特聘教授支持计划等课题的资助！

陈晶晶

2010年11月18日

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