植物染色体系列实验报告
摘 要：植物染色体的制备及研究是遗传学实验中一个重要的学习内容，在遗传学中，学者们常常要对动植物的染色体进行各种分析，这就需要有过硬的染色备技能。植物染色体系列实验包括减数观察、低渗发染色体标本制备、植物染色体Giemsa N 带技术、植物染色体的核型分析，通过以上实验可以掌握染色体的制备以及染色、核型分析等技术掌握。
关键词：植物染色体；减数；Giemsa N 带；核型分析；
1 实验设计方案
1.1 实验原理 1.1.1 减数
在高等生物中雌雄性细胞形成过程中，首先是由有性组织，如植物的花药和胚珠，动物的精巢和卵巢中的某些细胞分化为性母细胞（2n），这些细胞再进行连续两次的细胞分离过程，最终形成４个小孢子或精细胞，或分别形成一个大孢子或卵细胞和三个退化的极体（1n）。减数过程的主要特点是，连续两次核，而染色体仅复制一次，最后形成的四个子核，每个核仅含有单倍的染色体数目，即染色体数减少一半；其次，前期特别长，而且变化复杂，分为细线期、偶线期、双线期、终变期等，其中包括同源染色体的配对、交换及分离等。在减数过程中，通过对染色体形态和数量的动态变化的观察，可为遗传学研究中远缘杂种的分析，染色体工程中的异系鉴别，常规的染色体组型分析以及遗传学的三个基本规律的论证，提供直接或间接的依据。 1.1.2 植物染色体标本制备
植物染色体标本的制备，过去一直是采用醋酸洋红压片法。近年来，有人将动物染色备的方法，运用到植物材料中来，已取得了进展。我国科学家陈瑞阳教授等，在1979年以来利用对植物细胞去壁、低渗、火焰干燥的方法，作了大量的工作，实验证明这种方法是可行的，也是很有前途的。植物细胞与动物细胞的不同在于它外面具有坚实的细胞壁，因此要想将制备动物细胞染色体的方法，应用于植物中就必须将植物细胞壁去除，这样使细胞的原生质体裸露，然后采用动物染色体的制备技术──低渗，使细胞膨胀染色体扩散，然后进行砸片操作将
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染色体分开。
1.1.3 植物Giemsa N 带技术
染色体分带的机理并不是十分清楚的，现在大多数人认为DNA 含量高的区域就是带的区域，这个区域可抵抗酸、碱、酶等显带处理，不易变性。这样重染色后仍然着色。
染色体分带使染色体除形态特征（长度、着丝点位置、臂比，副缢痕随体等）之外又增添了一个新的标志，可作为鉴别染色体的重要依据，并在研究染色体成分、结构、行为功能等方面有着十分重要的意义，并已应用于医疗诊断，植物育种等方面。
N带（核仁组成区带）— 核仁组成区的异染色质与其它部位的异染色质有所区别。但现今在植物方面也常用这一技术显示染色体的其它部位，如着丝粒，染色体臂上的某些特殊区带等。 1.1.4 植物染色体的核型分析
染色体核型分析是阐明生物染色体组的构成，从而为物种的起源和进化的研究提供客观根据，为调查异源染色体的附加、代换乃至易位提供细胞学证明。
植物染色体的核型分析，往往从细胞的形态学特点来分析。它所依靠的形态学指标是1.染色体长度；2.着丝粒位置；3.副缢痕的有无和位置；4.随体的有无、形状和大小。 1.2 实验材料
玉米雄花序，在雄花花序中，有大量的花粉母细胞，可以分离出大量的正在进行减数的花粉细胞，用于实验观察。
大麦根尖，根尖是植物细胞旺盛的部位，用秋水仙素处理后，正在进行的细胞，染色体失去纺锤丝的牵引会停滞于细胞的中期。染色体大多数都呈棒状排列，便于观察。
表1-1：其他主要实验仪器及药品
实验仪器
显微镜、冰箱、载玻片、单面刀片、吸管 烧杯、酒精灯、解剖针、盖玻片、吸水纸 改良苯酚品红溶液、Giemsa母液、冰醋酸 甲醇、2.5％混合酶液、0.2％秋水仙素溶液
实验药品
1.3 实验安排
玉米雄花花序，由实验室提供，保存于4℃冰箱中，备实验使用。
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对于大麦根尖实验，需要使用新鲜的实验材料，在实验前需要预实验进行培养测定实验是提供的大麦种子的发芽率及发芽时间。根据预实验测定在23℃条件下，经过13h种子可以长出约1cm的根。实验安排时间如下表格：
表1-2：植物染色备具体时间安排
实验时间
11月09日 17 : 00 11月10日 08 : 00 11月10日 12 : 30 11月10日 13 : 15 11月10日 15 : 55 11月10日 16 : 30 11月10日 17 : 50
对种子进行培养
实验预处理：用2%秋水仙素浸泡根长为1cm左右的种子 进行前低渗处理30 min
用纤维素酶、果胶酶的混合酶液酶解处理2 h 30 min（摇床中） 进行低渗处理 30 min 进行染色体固定30 min
对涂片进行Giemsa 染色。染色30 min
实验内容
2 实验过程
2.1 玉米花药涂片
取合适大小玉米花蕾，放到载玻片上将玉米花冠剥开，使花药显露，去除其余部分，滴一滴改良苯酚品红于载玻片上，使花药浸在染液中，然后用解剖针轻压花药，使花粉母细胞挤出，用镊子将花药壁去除掉后，染色 5—10 分钟，加盖玻片。在盖玻片上复一层吸水纸，用手指轻轻下压，但勿使盖片移动，即可镜检，从不同的压片中观察减数不同时期及染色体动态。 2.2 植物染色备
1）取材：作为染色备材料部位必须准确，如根尖、芽、节间等部位（即细胞正处在生长旺盛时期）；材料必须少而精、忌多而杂；同时材料要新鲜。在本实验中要将种子浸泡一天，然后摆种待根长出1 厘米左右即可。
2）预处理：将已长出根的种子浸泡在0.2％秋水仙素溶液中在25℃中培养4小时。
3）前低渗：切取根尖（1-2mm左右）30个放入蒸馏水中，动作要迅速，不要使根尖缺水。在25℃左右条件下处理30分钟。
4）酶解：吸干水、加入混合酶液刚好没过材料即可，切忌过多，在25℃下酶解2－4小时，酶解时间还得凭经验多次掌握才行。
5）低渗：将酶液去除后，在酶解材料瓶中慢慢加入25—30℃双蒸水，轻轻冲洗2－3次，加入双蒸水根据酶解消化程度，在双蒸水中停留10－40分钟进行复渗处理。
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6）固定：低渗后的材料，用3∶1的甲醇∶冰醋酸固定30分钟。 7）涂片：将材料放在预先在蒸馏水中冷冻的清洁载片上，然后用镊子尖迅速将材料敲碎涂布，再滴一滴固定液用嘴吹，使细胞均匀的散开在载片上，动作要迅速。
8）干燥：迅速将载片移到酒精灯上过火1－2次，然后将载片在空气中干燥，才可进行染色。
9）染色：将Giemsa 母液用蒸馏水1：20稀释、进行染色。
染色方法是将有材料的面朝下放到已经制作好的染色板上，然后往载片与玻璃板之间的空隙加染液，注意要从一个方向，防止起泡产生，染色15—30分钟即可。染色后将载片背面在自来水上冲洗一下，迅速甩掉附在载片上的水，在空气中干燥后，可进行镜检。 2.3 植物染色体 N 显带处理
将1M NaH2PO4溶液倒入立式染缸，放入恒温水浴锅中，然后将水浴锅打开加热，溶液中插一根温度计，把标本制片放在水浴锅上预热，切忌水浴锅水已热时再放入染缸，以防染缸破裂。当温度计指示在96℃时，将标本载片放进。后温水处理，自然干燥，进行Giemsa 染色，镜检。 2.4 植物染色体核型分析
1 剪贴：用眼科剪刀，沿染色体边缘将每一条染色体剪下来，存放在小培养皿内。 2 配对：首先目测配对，根据染色体长短和形态特征，进行同源染色体配对。 3 排列：按一定顺序将一个细胞内的染色体进行排队、编号。排列方式有多种，一般从大到小排列，如玉米、草棉核型；相同长度的染色体，按短臂长度排列，短臂长的在前；有特殊标记的染色体（如随体）可特殊排列，如栽培大麦核型；性染色体单独另排或放在最后。也可将形态相同的染色体归为一组，分成若干组，按组排列，如山羊草属植物染色体核型；异源多倍体要根据不同染色体组排列，如普通小麦核型要按A、B、D三个染色体组排列。 4 测量：利用测量工具，测量染色体的如下数据： 1）绝对长度＝照片长度/放大倍数 2）每对染色体短臂绝对长度； 3）每对染色体长臂绝对长度； 4）染色体短臂总长度；
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5）染色体长臂总长度； 6）相对长度；
a、每对同源染色体短臂相对长度：
短臂相对长度＝染色体短臂绝对长度／染色体短臂总长度 b、每对同源染色体长臂相对长度：
长臂相对长度＝染色体长臂绝对长度／染色体长臂总长度 c、每对同源染色体相对长度：
染色体相对长度＝每对同源染色体绝对长度／染色体总长度 7）臂比:臂比＝染色体长臂／染色体短臂 8）臂指数:着丝点指数＝短臂长／染色体全长
3 实验结果及分析
3.1 植物减数
上图中的植物染色体处于细胞的粗线期，在这一时期，已完成染色体联会的两条同源染色体互相紧靠，进而缠绕在一起，基质开始附着到染色丝上，成为一条短而粗的染色体。结果在这时期后外观上是染色体数目减半（即假减数）。不久，这些紧靠着的一对染色体各自明显地发生纵裂，各自由两条染色单体构成，成为四重结构。
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3.2 植物染色备
以上为植物染色体的图片，植物细胞是由细胞壁包被的，如果想要进行染色的观察，需要将细胞壁除去。植物细胞壁的主要成分是纤维素和果胶，可以用纤维素酶和果胶酶进行处理。本实验中，用混合酶液处理2.5 h ，但处理效果不是很好。图中可以看到染色体放射状排列，可以数出染色体条数为14条，但是由于酶解不完全，或者砸片的高度不够，导致细胞为完全破碎，而且染色时间控制有问题，所以上图中的细胞碎片也被着色，影响植物染色体的观察。 3.3 植物染色体的核型分析
表3-1：染色体核型分析表1
序号 1 2 3 4 5 6 7 长臂长（mm） 6.0 6.0 6.0 5.5 5.5 5.5 6.0 短臂长(mm) 7.5 7.0 7.0 7.0 6.5 7.0 6.0 总长序（mm） 13.5 13.0 13.0 12.5 12.0 12.5 12.0 臂比 1.25 1.17 1.17 1.27 1.18 1.27 1 臂指数 0.44 0.46 0.46 0.44 0.46 0.44 0.50 5
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序号 8 9 10 11 12 13 14 长臂长（mm） 6.0 5.0 5.0 4.0 4.0 6.0 6.0 短臂长(mm) 6.0 7.0 7.0 6.5 6.5 8.0 8.0 总长序（mm） 12.0 12.0 12.0 10.5 10.5 14.0 14.0 臂比 1 1.40 1.4 1.63 1.63 1.33 1.33 臂指数 0.50 0.42 0.42 0.38 0.38 0.43 0.43 根据上表中数据计算可以得到：
染色体短臂总长度为：76.5 染色体长臂总长度为：90.0
计算各染色体的短臂及长臂的相对长度、以及分析染色体类型，将结果记入下表中：
表3-2：染色体核型分析表2
序号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 短臂先对长度 0.078 0.078 0.078 0.072 0.072 0.072 0.078 0.078 0.065 0.065 0.052 0.052 0.078 0.078 长臂相对长度 0.083 0.078 0.078 0.078 0.072 0.078 0.067 0.067 0.078 0.078 0.072 0.072 0.0 0.0 全长相对长度 0.161 0.156 0.156 0.150 0.144 0.150 0.145 0.145 0.143 0.143 0.124 0.124 0.167 0.167 类型 m m m m m m Sm Sm m m m m m m
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根据臂比将染色体分类见下表中分类标准：
表3-2 染色体分类标准
染色体类型
正中部着丝点类型（M） 中部着丝点类型（m） 近中部着丝点类型（Sm） 近端着丝点类型（St） 端着丝点类型（t） 顶端着丝点类型（T）
臂比（长臂／短臂） 1.0 1.01－1.7 1.71－3.0 3.01－7.0 7.01-
公式：根据染色体类型，可以将一种生物的染色体核型书写成一定公式。如：芍药核型为：K(2n)=2X=10=6m+2Sm+2St(SAT)。K代表基本核型，SAT代表具随体染色体，写在括号内，符号前的数字代表该类染色体数目。
分析。由上述各表及结果，得出大麦根尖细胞染色体的核型公式为：
K(2n) = 2x = 14 = 8m +2sm +4St
核型分析图如下：
4 讨论
4.1 注意事项
1） 在酶解时注意将将酶液没过材料，切勿多加。
2） 酶解时间要根据实验材料而定，要如果酶解不充分，实验制片会受到影响。 3） 酶解后的材料要注意切勿过大的晃动，否则会使原生质体破碎 4） 在滴片过程中，注意不要将冰水膜破坏，使得张力不够而影响效果 5） 在过火时，注意将过火时间次数控制好，否则会使染色体变形。 6） 染色时候，要注意分清楚涂片面，与非涂片面，否则会丢失材料。 4.2 小结
通过植物染色体系列实验，掌握了低渗法植物染色体标本制备、掌握 Giemsa
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分带的技术和方法、初步掌握染色体核型分析的方法。观察到了，处于减数时期的花粉母细胞，处于旺盛的细胞中期细胞。通过本次实验，让我了解到了实验前期的预习的重要性，以及实验操作仔细的重要性。这次实验全面训练了我们的实验操作技能以及让我们体会了团队的协作是实验成功的不可缺少的因素之一。
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