肝素对大鼠胰岛细胞保护作用的实验研究

临床医药实践杂志２００８年１月第１７卷第６期　・４０１・　文章编号：１６７１—８６３１（２００８）０６—０４０１—０２　肝素对大鼠胰岛细胞保护作用的实验研究¨　吴东军，赵振林，贺富荣　（山西医科大学第二医院，山西太原０３０００１）　摘要　目的：探讨胰腺切取前全身肝素化对大鼠胰岛细胞的保护作用。方法：Ｗｉｓｔｅｒ大鼠２Ｏ只被随机分为两组，　肝素化组胰腺切取前经门静脉注入肝素３　ｍｇ／ｋｇ，全身肝素化后切取胰腺，非肝素化组胰腺切取前经门静脉注入等容　量生理盐水，采用酶消化法分离胰岛，双硫腙（ＤＴＺ）染色鉴定并记数胰岛细胞，ＡＯ—ＰＩ染色计算存活率，胰岛素释放　试验检测胰岛细胞功能。结果：肝素化组：胰岛细胞的产量为每克（８９７±１６９）个，纯度８６　，存活率９Ｏ　，胰岛素释放　试验高糖组为（５０６－＋－９６．３６）／ＨＮ／ｍＬ。低糖组为（３２９±５９．１７）／ＨＮ／ｍＬ；非肝素化组：胰岛细胞的产量为每克（６２０±　１５０）个，纯度７Ｏ　、存活率８５　，胰岛素释放试验高糖组为（３００±５０．２３）／ＨＮ／ｍＬ低糖组为（２００±４５．１２）／ＨＮ／ｍＬ。　两组对应指标比较Ｐ＜０．０５。结论：肝素对胰岛细胞具有保护作用，胰腺切取前全身肝素化可以作为预处理手段应用　于胰岛细胞移植。　关键词胰岛细胞；肝素；预处理　中图分类号：Ｒ５８７　文献标识码：Ａ　Ｓｔｕｄｙ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖａｎｃｙ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｏｎ　ｒａｔ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ＷＵ　Ｄｏｎｇ—ｊｕｎ．ＺＨＡＯ　Ｚｈｅｎ—ｌｉｎ。ＨＥ　Ｆｕ—ｒｏｎｇ　（Ｔｈｅ　Ｓｅｃｏｎｄ　Ｈｏｓｐｉｔａｌ　ｏｆ　Ｓｈａｎｘｉ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔａｉｙｕａｎ　０３０００１，Ｃｈｉｎａ）　Ａｂｓｔｒａｃｔ　０ｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｔｏ　ｉｎｖｅｓｉｇａｔｅ　ｔｈｅ　ａｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｏｎ　ｒａｔ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌ１．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｗｉｓｔｅｒ　ｒａｔｓ　ｗｅｒｅ　ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ　ｉｎｔｏ　ｔｗｏ　ｇｒｏｕｐｓ：ｈｅｐａｒｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ａｎｄ　ｔｈｅ　ｇｒｏｕｐ　ｏｆ　ｎｏｎ—ｈｅｐａｒｉｎ，ｈｅｐａｒｉｎ　ｇｒｏｕｐ．Ｉｎ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｇｒｏｕｐ，ｈｅｐａｒｉｎ　ｗａｓ　ｉｎｊｅｃｔｅｄ　ａｔ　ｔｈｅ　ｄｏｓｅ　ｏｆ　３　ｍｇ／ｋｇ　ｂｙ　ｔｈｅ　ｗａｙ　ｏｆ　ｐｏｒｔａｌ　ｖｅｉｎ　ｂｅｆｏｒｅ　ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎ　ｎｏ—ｈｅｐａｒｉｎ　ｇｒｏｕｐ，ｈｅｐａｒｉｎ　ｗａｓ　ｒｅｐｌａｃｅｄ　ｂｙ　ｓａｌｉｎｅ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｏｆ　ｅｎｚｙｍｅ　ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ　ｄｉｓｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ　ｇｒａｄｉｅｎｔ　ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ　ｗｅｒｅ　ｅｍｐｌｏｙｅｄ　ｔＯ　ｉｓｏｌａｔｅ　ａｎｄ　ｐｕｒｉｆｙ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌｓ．ＤＴＺ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ａｎｄ　ＡＯ—ＰＩ　ｓｔａｉｎｉｎｇ　ｗｅｒｅ　ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ　ｔｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ　ｖａｌｉｄ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌｓ．Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｔｅｓｔｓ　ｗｅｒｅ　ｃａｒｒｉｅｄ　ｏｕｔ　ｔＯ　ｅｘａｍｉｎｅｄ　ｔｈｅ　ｆｕｎｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌ１．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｉｎ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｇｒｏｕｐ，ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ（８９７±１６９）／ｇ，ｐｕ—　ｒｉｔｙ：８６　，ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　９０　．Ｉｎｓｕｌｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｔｅｓｔ：ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ（３２９±５９．１７）ＩＨＮ／ｍＬ；ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｇｒｏｕｐｓ：　（５０６－＋９６．３６）ＩＨＵ／ｍＬ．Ｎｏｎ—ｈｅｐａｒｉｎ　ｇｒｏｕｐ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌｓ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ（６２０￣１５０）／ｇ，ｐｕｒｉｔｙ　７０　，ｓｕｒｖｉｖａｌ　ｒａｔｅ　８５％ｉｎ—　ｓｕｌｉｎ　ｒｅｌｅａｓｅ　ｔｅｓｔ　ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ（３００±５０．２３）Ｉ￣ＩＮ／ｍＬ　ｔｈｅ　ｌｏｗ　ｇｌｕｃｏｓｅ　ｇｒｏｕｐ（２００±４５．１２）ＩＨＮ／ｍＬ．Ｃｏｒｒｅ—　ｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｉｎｄｅｘｅｓ　ｏｆ　ｔＷＯ　ｇｒｏｕｐｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｍｐａｒｅｄ，Ｐ＜Ｏ．０５．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｈｅｐａｒｉｎ　ｐｏｓｓｅｓｓ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ　ｏｎ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌｓ，ｐｒｅ—ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍｉｃ　ｈｅｐａｒｉｎ　ｃａｎ　ｂｅ　ｕｓｅｄ　ａｓ　ａｎ　ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｍｅｔｈｏｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａ—　ｔｉｏｎ．　Ｋｅｙ　ｗｏｒｄ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ；ｈｅｐａｒｉｎ￣ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ　胰岛细胞移植已经成为治疗１型糖尿病和部分２型尿　食物自由摄取，由山西医科大学动物实验中心提供。试剂：胶　病的有效手段，而且能有效防止糖尿病并发症的发生和发　原酶Ｖ（１　ｍｇ／ｍＬ），胎牛血清，Ｆｉｃｏｎｌｌ液（ｓｉｇａｍ公司提供），　展口　，但是如何提高胰岛细胞产量，提高胰岛细胞的纯度，并　１６４０培养液，ｈａｎｋｓ液，肝素（自制），双硫腙（ＤＴＺ）染料，ＡＯ—　且提高胰岛细胞的活力以及功能，减少胰岛细胞的免疫原　ＰＩ，胰岛素放射免疫试剂盒（ｓｉｇｍａ公司进口分装）等。仪器：　性　，提高移植质量，却仍然困扰着胰岛细胞移植的进一步　低温水平离心机，倒置显微镜，ＣＯ。培养箱等，超净工作室。　开展。本实验采用预处理手段，研究肝素的应用是否能提高　１．２方法　胰岛细胞的产量、活性，报告如下。　１．２．１实验分组　１资料与方法　Ｗｉｓｔｅｒ大鼠２Ｏ只，随机分为两组：第一组肝素化组，门　１．１一般资料　静脉注入肝素３　ｍｇ／ｋｇ，第二组非肝素化组，门静脉注入等　Ｗｉｓｔｅｒ大鼠共２Ｏ只，体重２５０￣３００　ｇ，雌雄不限，水和　量生理盐水代替肝素。　［１］本课题为山西省自然科学基金资助，项目编号：２００６０１１１１７。　维普资讯 http://www.cqvip.com

・４０２・　Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇ　ｏｆ　Ｃｌｉｎｉｃａｌ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　Ｊ，Ｊｕｎ．２００８，Ｖｏｌ　１７　Ｎｏ．６　１．２．２肝素化与胰腺摘取　果差异有显著性。　２结　果　取鼠腹正中“十”字形切口，剑突１Ｏ号线牵引固定，暴露　门静脉，１　ｍＬ注射器抽取肝素３　ｍｇ／ｋｇ经门静脉注入，纱布　按压注射ＥＩ止血。非肝素化组经门静脉注入等量生理盐水。　充分暴露胰腺近十二指肠端暴露一小段胆总管，０号线穿越　２．１胰岛素计数　肝素化组每克（８９７±１６９）个，非肝素化组每克（６２０±　１５０）个。　胰管备用，距肝门５　ｍｍ处０号线穿越胆总管备用，胆总管顺　行插入套管针，结扎胆总管肝门端，注入生理盐水少许，以排　２．２胰岛素含量测定（见表１）　表１胰岛素含量的测定Ｔｒ＋＿ｓ，ｔｄＮ／ｍＬ　空胆总管内胆汁，然后结扎胆总管十二指肠端。剪开心脏放　血后立即注入胶原酶于胰管内，见胰腺肿胀且为粉红色，完　整切除胰腺后放入装有８　ｍＬ　Ｈａｎｋｓ溶液的离心管中，放入　冰浴盒中，尽量去除脉管系统、淋巴结、脂肪。　１．２．３胰岛细胞分离纯化　将处理后的胰腺剪碎，然后移入锥形瓶中，３７ｌＣ水浴震　３讨　一论　直以来，胰岛细胞移植的产量和纯度是胰岛细胞移植　荡消化１０　ｍｉｎ，观察消化状态，以糊状不挂壁为宜，消化充分　后立即倒入４ｌＣ胎牛血清５　ｍＥ，加入Ｈａｎｋｓ溶液１Ｏ　ｍＬ，冰　屑上终止消化。然后使悬液通过１００目不锈钢滤网，组织沉　淀物准备纯化。采用Ｆｉｃｏｌｌ不连续密度梯度离心法，将消化　物悬浮于３　ｍＬ质量浓度为２５０　ｇ／Ｌ的Ｆｉｃｏｌｌ溶液中（密度　的关键问题，也是难点所在。而胰岛细胞的移植也面临着移　植排斥反应，如果能够提高胰岛细胞的纯度，减少杂细胞的　干扰，这样就可以降低免疫原性，提高移植成功率。肝素的抗　凝作用是通过加强和加速抗凝血酶Ⅲ（ＡＴⅢ）的作用而发挥　的。肝素与ＡＴⅢ形成复合体后，促进凝血酶一ＡＴ复合体形　成，从而抑制凝血酶的作用。凝血酶一ＡＴⅢ复合体形成后将　减少对肝素的亲和力，使肝素得以解脱，在反应中再起催化　作用。肝素也抑制活化的因子ＩＸ、ｘ、Ⅺ、Ⅻ、Ⅶ。实验中利用　１．０８４　ｇ／ｍＬ的溶液），在其上依次加入质量浓度２３０　ｇ／Ｌ（密　度１．０７７　ｇ／ｍＬ）、２００　ｇ／Ｌ（密度１．０６８　ｇ／ｍＬ）及１１０　ｇ／Ｌ（密　度为１．０３８ｇ／ｍＥ）的Ｆｉｃｏｌｌ溶液各１．５ｍＬ。然后在４ｌＣ下　３　０ＯＯｒｐｍ，１　５ｍｉｎ，并且收集密度为１．０７７／１．０８４ｇ／ｍＬ，　１．０６８／１．０７７　ｇ／ｍＬ与１．０３８／１．０６８　ｇ／ｍＬ界面的细胞团，　肝素的性质，在切取胰腺前，门静脉注入肝素，使血液肝素　化，降低血液的凝血性。这样剪开心脏放血时就会减少血液　中免疫细胞及其他细胞的残留，提高胰岛细胞的单一性，从　而可以提高胰岛细胞的的纯度（８６　），同时减少移植后的免　洗涤纯化后收集界面细胞团，洗涤后加入１　ｍＬ　Ｈａｎｋｓ液备　用。这一阶段在超工作间进行，整个过程保持无菌操作［３］。　１．２．４计数　用ＤＴＺ染色后，显微镜观测计数，并计算纯度。　１．２．５胰岛细胞形态学鉴定　疫原性。通过实验可以看到使用肝素可以保护细胞，提高细　胞的活性（５Ｏ６±９６．３６）／ｌｌＮ／ｍＬ。肝素的使用可以减少炎症　因子的释放，减少对胰岛细胞的损伤，保护胰岛细胞。胰岛细　用倒置显微镜动态观察胰岛形态学变化；ＤＴＺ染色后观　察。　胞移植的确还存在许多问题，但是胰岛细胞移植是治疗治疗　１型糖尿病和部分２型糖尿病的有效手段已经是不争的事　实。通过不懈的努力，随着问题的解决，胰岛细胞的移植最终　将成为治疗糖尿病的常规手段。　参考文献：　［ｔ］Ｗｈｉｔｅ　Ｓ　Ａ，Ｋｉｍｂｅｒ　Ｒ，Ｖｅｉｔｅｈ　Ｐ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｓｕｒｇｉｃａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｉａｂｅｔｅｓ　ｒｅｅｌ　ｌｉｔｕｓ　ｂｙ　ｉｓｌｅｔ　ｃｅｌｌ　ａｎｄ　ｐａｎ—　１．２．６胰岛功能鉴定　根据细胞培养液配比不同分为３组：无糖组（ＰＰＭＩ，　１６４０培养液，含１０％胎牛血清、１　双抗：青霉素１００　Ｕ／ｍＬ　和链霉素１００　ｇ／ｍＬ；低糖组（ＰＰＭＩ，１６４０培养液，含１０％胎　牛血清、１　双抗、５．５　ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）；高糖组（ＰＰＭＩ．１６４０　培养液，含１０％０胎牛血清、１　双抗、１６．５　ｍｍｏｌ／Ｌ葡萄糖）。３　组各取２　ｍＬ，３７　Ｃ，体积浓度９５％Ｏ　和５％Ｃ０　下过夜培　养，用间接免疫法测定胰岛素含量。　１．２．７统计学分析　ｃｒｅａｓ　ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ　ＥＪ３．Ｐｏｓｔｇｒａｄ　Ｍｅｄ　Ｊ，２００１，７７　（９０８）：３８３—３８７．　［２］Ｃａｔｔａｎ　Ｐ，Ｂｅｍｅｙ　Ｔ，Ｓｃｈｅｎａ　Ｓ，ｅｔ　ａ１．Ｅａｒｌｙ　ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ　ｏｆ　ａｐｏｐｔｏｓｉｓ　ｉｎ　ｉｓｏｌａｔｅ　ｉｓｌｅｔｓ　ｏｆ　ｌａｎｇｅｒｈａｎｓＥＪ］．Ｔｒａｎｓ—　ｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００１，７１（７）：８５７—８６２．　数据采用Ｙ＋ｓ表示，进行组问比较，Ｐ＜０．０５示组内结　［３］　王贵玉，崔云甫，曹博，等．一种改良的大鼠分离方法　ＥＪ］．哈尔滨医科大学学报，２００３，１２（６）：４７７—４７９．　收稿日期：２００８一Ｏ１—２９　作者简介：吴东军（１９８１一），男，山西省朔州市人，硕士在读，研究方向：移植免疫。